MicroRNA-134调控环腺苷酸应答元件结合蛋白对老年小鼠术后认知功能障碍的影响

目的探讨microRNA-134(miR-134)及环腺苷酸应答元件结合蛋白(cyclic AMP response element binding protein,CREB)在老年小鼠术后认知功能障碍发病机制中的作用。方法 68只老年C57BL/6小鼠随机分为4组:对照组(con)、异氟醚组(iso)、手术组(sur)、异氟醚+手术组(iso+sur)。对照组行假手术,异氟醚组1.8%异氟醚吸入1.5 h,手术组行局麻腹部手术,异氟醚+手术组1.8%异氟醚吸入1.5 h+局麻腹部手术。术后行Morris水迷宫实验评估小鼠认知功能,并分别于术后第1、3、7天取小鼠海马行q RT-PCR检测miR-134表达,Western blot检测CREB、Ser133位点磷酸化CREB(pCREB)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、突触后致密95(postsynaptic density 95,PSD95)的表达。结果与对照组相比,手术组小鼠术后水迷宫登台潜伏期延长(P<0.05),目标象限停留时间缩短(P<0.01),穿台次数减少(P<0.05);与手术组相比,异氟醚+手术组小鼠登台潜伏期缩短(P<0.05),目标象限停留时间延长(P<0.05)。与对照组相比,手术组小鼠海马组织miR-134表达增加(0.219±0.013 vs 0.277±0.017),p-CREB/CREB表达比值降低(0.655±0.025 vs 0.379±0.053),CREB、BDNF、PSD95表达减少(0.359±0.023 vs 0.307±0.027,0.377±0.031 vs 0.246±0.019,1.066±0.081 vs 0.839±0.098)(P均<0.05);与手术组相比,异氟醚+手术组小鼠海马miR-134表达减少(0.277±0.017 vs0.235±0.020),p-CREB/CREB表达比值升高(0.379±0.053 vs 0.605±0.037),CREB、BDNF表达增加(0.307±0.027 vs0.345±0.034,0.246±0.019 vs 0.341±0.017)(P均<0.05)。结论腹部手术致老年小鼠术后早期学习记忆功能受损,异氟醚吸入全麻下行腹部手术可缓解该损伤,可能的机制是手术创伤使海马中miR-134表达增加,抑制CREB活性,造成突触可塑性下降,引起学习记忆功能损伤。

微小RNA-134靶向调控环腺苷酸应答元件结合蛋白/脑源性神经营养因子通路对脑卒中后抑郁海马神经细胞的影响

目的探讨微小RNA-134(miR-134)对脑卒中后抑郁海马神经细胞的影响及相关作用机制。方法建立脑卒中后抑郁大鼠模型,分离海马组织及海马神经细胞,并将体外培养的海马神经细胞分为对照组、miRNA NC组(转染miRNA NC)和miR-134 siRNA组(转染miR-134 siRNA)。实时荧光定量PCR法检测海马组织及海马神经细胞miR-134及环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)1、脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA表达水平,Western blotting法检测海马组织及海马神经细胞p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白表达情况,CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,双荧光素酶报告基因实验验证miR-134与CREB1的靶向作用关系。结果与正常组相比,造模组大鼠海马组织中miR-134表达水平显著升高,CREB1、BDNF mRNA水平及p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白水平显著降低(均P<0.05)。与对照组、miRNA NC组相比,miR-134 siRNA组海马神经细胞中CREB1、BDNF mRNA水平,p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白水平及细胞吸光度(OD)值显著升高,细胞凋亡率显著降低(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,在海马神经细胞中,miR-134可靶向CREB1表达。结论miR-134可能通过靶向抑制CREB表达,进而下调BDNF表达,抑制脑卒中后抑郁海马神经细胞增殖并促进其凋亡。

环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)参与人hsp90β基因的热诱导表达

为研究ｃＡＭＰ应答元件（ＣＲＥ）在人热休克蛋白ｈｓｐ９０β基因表达中的作用，构建了数个受ｈｓｐ９０β基因不同长度调控片段介导的氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）报告基因质粒．分别转染Ｊｕｒｋａｔ细胞并检测４２℃１ｈ热诱导前后 ＣＡＴ活性．结果发现删除ｈｓｐ９０β基因上游含ＣＲＥ片段（－１７３／－９１ｂｐ）后，ＣＡＴ的热诱导表达活性降低了６７％．电泳迁移率变更分析（ＥＭＳＡ）显示热休克后Ｊｕｒｋａｔ细胞的核抽提物中磷酸化的ＣＲＥＢ与该片段呈特异性结合．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验及ＰＫＡ活性检测发现ＣＲＥＢ的磷酸化程度及ＰＫＡ活性均随热诱导时间的延长而增加．以上结果表明：磷酸化的ＣＲＥＢ通过与ｈｓｐ９０β因上游的ＣＲＥ结合参与该基因的热诱导表达，并可能与ＰＫＡ传导途径有关．

多次氯胺酮麻醉对未成年大鼠学习记忆能力和磷酸化环腺苷酸应答元件结合蛋白的影响

目的探讨多次氯胺酮麻醉对未成年大鼠记忆能力的影响及其可能机制。方法21日龄筛选合格SD大鼠64只，分为氯胺酮组（包括k1和k7两个亚组：氯胺酮75mg／kg腹腔注射，每日1次，连续注射7d，分别于第8天和第14天进行首次训练，一部分训练结束1h取材，一部分3d后再次训练）、生理盐水组（注射等体积的生理盐水）、假训练组（取生理盐水组平均训练时间、次数训练，训练结束1h取材）、正常组（迷宫中适应5min取材）。采用Y型迷宫进行记忆能力测试，应用免疫组化法检测海马磷酸化环腺苷酸应答元件结合蛋白（p-CREB）的表达。结果k1组学习次数、时间[分别为（51．88±15．93）次，（53．38±19．03）min]高于生理盐水组[分别为（25．50±6．78）次，（21．88±8．11）min]（P〈0．05），k1组记忆保持率、P—CREB蛋白阳性神经元[分别为（61，25±6．41）％，（28．62±2．92）个]低于生理盐水组[分别为（87．50±13．89）％，（71．13±7．23）个]（P〈0．05）；而k7组[分别为（22．75±7．65）次，（24、13±9．01）min，（87．50±10．35）％，（71．00±6．93）个]，与生理盐水组相比差异无统计学意义。正常组p-CREB蛋白阳性神经元[（7．75±1．28）个]低于生理盐水组和氯胺酮组（P〈0．05），但与fKiJiI练组[（7．75±1．49）个]相比差异无统计学意义。结论多次氯胺酮麻醉可短期影响未成年大鼠记忆能力，其机制可能与抑制海马p-CREB表达有关。

七氟醚-N2O麻醉对青年小鼠空间学习和记忆功能及pCREB和Egr1表达的影响

目的研究七氟醚-N2O麻醉后青年小鼠的空间学习和记忆能力以及海马磷酸化环腺苷酸应答元件结合蛋白(phosphorylated cyclic AMP response element-binding protein,pCREB)和早期生长反应因子1(early growth response factor 1,Egr1)的表达,并与老年小鼠进行比较。方法12只3月龄和12只18月龄小鼠随机分为对照组和实验组,每组各6只。48 h后进行为期6天的获得训练。获得训练结束后24 h进行空间探索实验,实验结束后15 min收集两组小鼠的海马组织,通过Western blot和实时定量PCR方法评估pCREB和Egr1的表达水平。结果未见麻醉损害青年小鼠的空间学习和记忆功能以及海马中pCREB和Egr1的表达水平,麻醉组与对照组比较差异均无统计学意义;而老年小鼠Sev+N2O组在麻醉后第4、5、6天逃逸潜伏期显著长于对照组(P<0.05),两组小鼠游泳速度差异无统计学意义;在空间探索实验中,Sev+N2O组目标象限路程百分比和时间百分比显著低于对照组(P<0.01);海马中pCREB和Egr1的表达水平均较对照组显著下降(P<0.05)。结论七氟醚-N2O麻醉对青年小鼠的空间学习记忆能力没有损害,也不影响海马中pCREB和Egr1的表达,但会对老年小鼠造成损害。

miR-134/CREB/BDNF通路在低频重复经颅磁刺激影响癫痫大鼠抑郁、焦虑样行为中的作用

目的基于微小RNA(miR)-134/环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)/脑源性神经营养因子(BDNF)通路探究低频重复经颅磁刺激(rTMS)影响癫痫大鼠抑郁、焦虑样行为的作用机制。方法36只SD大鼠随机分为正常对照组(NC组)、假刺激组(s-rTMS组)及rTMS刺激组(rTMS组),采用强迫游泳和旷场实验检测抑郁样行为;采用高架十字迷宫实验及新颖环境抑制摄食测试检测焦虑样行为,实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测海马miR-134、CREB及BDNF mRNA相对表达量,Western印迹检测海马CREB、p-CREB、BDNF蛋白表达。结果与NC组比较,s-rTMS组不动时间、摄食潜伏期、海马CREB、BDNF相对表达量显著增加,水平站立次数及垂直站立次数、总穿臂次数(TE)、进入开放臂次数的比例(OE%)、开放臂停留时间比例(OT%)、海马miR-134相对表达量显著减少(P<0.05);与s-rTMS组比较,rTMS组不动时间、摄食潜伏期、海马CREB、BDNF相对表达量显著减少,水平站立次数及垂直站立次数、TE、OE%、OT%、海马miR-134相对表达量显著增加(P<0.05)。结论低频rTMS可减轻癫痫大鼠抑郁、焦虑样行为,可能与调控miR-134/CREB/BDNF通路有关。

人肝中硒蛋白K相互作用蛋白的筛选与验证

以硒蛋白K(SelK)突变体为"诱饵",采用酵母双杂交系统对人肝cDNA文库进行筛选,得到一个与SelK相互作用的蛋白──环腺苷酸应答元件结合蛋白3(CREB3).将SelK与CREB3共同转染酵母细胞,验证了SelK与CREB3的相互作用;并采用受体漂白、敏化发射和荧光寿命3种荧光共振能量转移方法进一步验证了二者间的相互作用,发现其不受SelK中硒代半胱氨酸(Sec)的影响.推测SelK可能通过其Sec之前的区域与CREB3发生作用,参与CREB3介导的内质网相关降解过程,影响相关癌症的转移和发展.

七氟醚麻醉对老年小鼠空间认知能力以及海马组织pCreb和Egr1表达的影响

目的探讨七氟醚麻醉对老年小鼠空间认知能力以及海马组织中磷酸化环腺苷酸应答元件结合蛋白(pCreb)和早期生长反应因子1(Egr1)表达的影响。方法将12只18月龄老年小鼠随机分为麻醉组和对照组,每组各6只。麻醉组小鼠吸入3%七氟醚4 h,而对照组小鼠吸入100%氧气4 h。水迷宫空间学习记忆能力测量在麻醉后48 h进行,获得训练结束后24 h进行空间探索试验。空间探索试验结束后15 min分离海马组织,通过Western blotting和实时定量PCR方法检测海马组织Egr1、Creb和pCreb的表达。结果麻醉组小鼠第4、5、6日逃逸潜伏期显著长于对照组(P<0.05);在空间探索试验中,对照组平台象限时间、路程百分比显著高于麻醉组(P<0.01)。与对照组比较,麻醉组小鼠海马组织Egr1的表达量显著下降(P<0.05);而两组Creb的表达量无显著差异(P>0.05),但麻醉组磷酸化水平下降(P<0.05)。结论七氟醚麻醉下调海马组织Egr1表达和Creb磷酸化水平,影响老年小鼠空间认知能力。

右美托咪定对七氟烷麻醉后老年小鼠认知功能障碍的影响

目的观察右美托咪定对七氟烷麻醉后老年小鼠认知功能障碍及海马组织磷酸化环腺苷酸应答元件结合蛋白(pCreb)、早期生长反应因子1(Egr1)表达的影响。方法昆明老年小鼠60只,随机分为对照组(n=20)、模型组(n=20)及实验组(n=20)。模型组与实验组小鼠均吸入3%七氟烷4 h,对照组吸入100%氧气4 h;其中实验组小鼠在吸入3%七氟烷前腹腔注射盐酸右美托咪定10μL;对照组与模型组腹腔注射0.9%氯化钠溶液10μL。用Morris水迷宫测试仪与旷场实验测定小鼠的认知功能;用免疫组化法与蛋白质印迹(Wb)法检测海马组织pCreb、Egr1蛋白表达。结果对照组、模型组及实验组小鼠第4天的逃逸潜伏期分别为(17.28±3.24),(27.73±5.92),(22.96±3.75)s;穿越原平台次数分别为(5.64±1.21),(2.97±0.72),(4.83±1.16)次;跨格次数分别为(90.21±18.02),(41.52±9.03),(73.64±17.11)次;直立次数分别为(11.63±3.37),(4.23±1.12),(8.56±1.54)次;中央格停留时间分别为(9.37±1.69),(32.83±7.65),(14.24±2.51)s。定位航行实验的第1~4天,3组小鼠的逃逸潜伏期均逐渐缩短,但模型组与实验组均明显长于对照组,实验组短于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,模型组小鼠穿越原平台的次数、跨格次数与直立次数均明显减少,实验组多于模型组,差异均有统计学意义(均P<0.05);而中央格停留时间延长,实验组短于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组海马组织pCreb、Egr1蛋白阳性细胞百分比与相对表达量均明显低于对照组,而实验组高于模型组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论右美托咪定可改善七氟烷麻醉后老年小鼠的认知功能,其作用机制可能与上调海马组织pCreb与Egr1蛋白表达相关。

咖啡因对小鼠空间学习记忆能力及有关脑区记忆相关蛋白CREB表达的影响

目的:研究咖啡因对小鼠空间学习记忆能力以及有关脑区记忆相关蛋白──环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)表达的影响。方法:C57BL/6J小鼠45只随机分成3组:咖啡因小剂量组(10mg·kg-1)、咖啡因大剂量组(50mg·kg-1)及生理盐水对照组,均腹腔给药。采用Morris水迷宫评价空间记忆能力及Western blot检测CREB的表达量。结果:与大剂量组及生理盐水对照组相比,咖啡因小剂量组定位航行实验逃避潜伏期显著缩短;空间搜索实验穿越原平台位置的次数显著增多;海马组织CREB表达显著增加。结论:小剂量咖啡因能够提高小鼠空间学习记忆能力,且增加海马区CREB的表达。

黑逍遥散对APP/PS1双转基因小鼠海马CREB1蛋白及其磷酸化表达的影响

目的探讨黑逍遥散治疗阿尔茨海默病的可能作用机制。方法 30只APP/PS1双转基因雄性小鼠随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组、黑逍遥散组,每组10只。同月龄、同种系的野生型C57BL/6雄性小鼠10只设为空白组。黑逍遥散组给予黑逍遥散6 g/(kg·d)灌胃,盐酸多奈哌齐组给予盐酸多奈哌齐片3. 25 mg/(kg·d)灌胃,模型组、空白组给予双蒸水0. 2 ml/10 g灌胃,各组均每日灌胃1次,连续3个月。采用Morris水迷宫于实验结束第1~5天进行定位航行实验观察逃避潜伏期,第6天开展空间搜索实验记录跨原平台次数。采用免疫组化法检测小鼠海马CA1、CA3及DG区环腺苷酸应答元件结合蛋白1 (CREB1)及磷酸化环腺苷酸应答元件结合蛋白1 (p-CREB1)表达。结果与空白组比较,模型组小鼠第1~5天逃避潜伏期明显延长,第6天跨原平台次数明显减少,小鼠海马CA1、CA3及DG区CREB1及p-CREB1蛋白表达显著降低(P <0. 05或P <0. 01)。与模型组比较,盐酸多奈哌齐组和黑逍遥散组各时间点逃避潜伏期均缩短,第6天跨原平台次数明显增加,小鼠海马CA1、CA3及DG区CREB1、p-CREB1蛋白表达显著升高(P <0. 05或P <0. 01)。黑逍遥散组和盐酸多奈哌齐组各指标组间比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论黑逍遥散可能通过调节海马CREB1及其磷酸化表达发挥防治阿尔茨海默病的作用。

左归丸治疗骨质疏松症相关机制

左归丸是中医经典方剂之一，为“阳中求阴”的代表方，具有滋肾补阴的功效和纯补无泻的特点。骨质疏松症是一种以骨量低，骨组织结构破坏，导致骨脆性增加，骨强度下降及骨折风险增加，易发生骨折为特征的全身性骨病，它已成为威胁人类健康的常见疾病之一。中医学有“肾藏精，主骨生髓”的理论，左归丸在治疗骨质疏松症方面有着较好的临床疗效，同时也具有较少的副作用。近年来，针对左归丸治疗骨质疏松症的实验研究数量与日俱增，相关分子以及信号通路的机制研究亦取得一定拓展，特别是左归丸治疗骨质疏松症的相关机制研究陆续涌现。本研究通过整理左归丸治疗骨质疏松症的文献，对其作用机制及信号通路，包括环腺苷酸（cAMP）／蛋白激酶（PKA）／cAMP应答元件结合蛋白（CREB）通路，Notch信号通路，转化生长因子巾，（TGF-卢，）／Smad信号通路，Wnt／卢一链蛋白（卢一catenin）信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等方面做一综述。这些研究表明左归丸治疗骨质疏松症具有多靶点、多途径的干预特点。虽然左归丸治疗骨质疏松症的疗效明确，且对于一些基本的机制研究亦取得一定进展，但仍存在一定的局限性，尚需结合现代最新研究方法和技术对其机制进行更全面更深入的探索。