表达幽门螺杆菌过氧化氢酶的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

目的构建表达幽门螺杆菌(Hp)过氧化氢酶的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗。方法采用缺失腺苷酸环化酶(△cya)、环腺苷酸受体蛋白(△crp)及天门冬氨酸β-半醛脱氢酶(△asd)的鼠伤寒沙门菌(X4072)作为宿主,将编码过氧化氢酶的基因CAT插入Asd+的组成型表达载体pYA248,通过两次转化引入宿主菌,构建表达过氧化氢酶基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4072(pYA248-CAT)。采用桥联法ELISA测定X4072(pYA248-CAT)培养上清液和裂解上清液中过氧化氢酶的抗原性,参照Meacock的方法及重组菌生长曲线的测定来确定重组菌株的稳定性,通过C57BL/6小鼠口服测定半致死量来确定重组菌的安全性。结果成功构建了表达过氧化氢酶的减毒鼠伤寒沙门菌重组菌株X4072(pYA248-CAT)。桥联法ELISA测定表明重组菌X4072(pYA248-CAT)培养上清中过氧化氢酶的含量高于菌体裂解液;重组菌pYA248-CAT在没有选择压力的情况下培养25代,随机挑选的重组菌全部都能生长,且在ELISA测定过氧化氢酶抗原时均显阳性;重组菌的生长曲线测定表明,X4072(pYA248)和X4072(pYA248-CAT)的生长状态基本一致。口服重组菌株X4072(pYA248-CAT) 1.0×1010 cfu,30 d后C57BL/6存活率仍为100%。

电针联合五子衍宗丸通过调节BDNF/TrkB/CREB信号通路对帕金森病小鼠的治疗作用

目的:观察电针联合五子衍宗丸对帕金森病小鼠黑质脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB)/环磷酸腺苷反应原件结合蛋白(CREB)通路的影响。方法:将108只雄性C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、电针组、五子衍宗丸组、联合观察组、抑制剂组、电针+抑制剂组、五子衍宗丸+抑制剂组、联合+抑制剂组9组,每组12只。除正常组、抑制剂组外,其余组给予1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)腹腔注射造模,第1天15 mg/kg,第2天20 mg/kg,第3~7天30 mg/kg,均0.2 mL/次,1次/d。自造模第1天进行干预,电针观察组别给予电针干预,五子衍宗丸观察组别早晚给予五子衍宗丸药液,抑制剂注射组别腹腔注射TrkB抑制剂ANA-12,连续干预14 d。干预结束后对比各组步态实验、旷场实验、爬杆实验结果,小鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)及BDNF、TrkB、CREB表达。结果:与正常组比较,模型组出现明显的运动障碍,黑质TH平均荧光强度及TH、BDNF、TrkB、CREB蛋白表达低(P<0.05);与模型组比较,电针组、五子衍宗丸组、联合观察组运动障碍均得到改善,黑质TH平均荧光强度及TH、BDNF、TrkB、CREB蛋白表达高(P<0.05);与电针组、五子衍宗丸组比较,联合观察组的运动障碍得到改善,其他指标表达增高(P<0.05)。结论:电针联合五子衍宗丸可能通过调控BDNF/TrkB/CREB信号通路来改善PD小鼠的运动障碍,保护多巴胺能神经元。

腧穴“解郁方”对慢性不可预测轻度应激抑郁大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴及BDNF/TrkB/CREB通路的影响

目的:观察腧穴“解郁方”对慢性不可预测轻度应激(CUMS)抑郁大鼠下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴和脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶B受体(TrkB)/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)信号通路的影响。方法:40只无特定病原体(SPF)级Sprague Danley(SD)雄性大鼠随机分为空白组(10只)、模型组(10只)、西药组(10只)、针刺组(10只),除空白组外,其余3组连续28 d构建CUMS抑郁大鼠模型,造模成功后,西药组连续14 d灌胃盐酸帕罗西汀混悬液,每日1次;针刺组针刺百会、太冲、神门,每日1次,每次20 min,连续针刺14 d。苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠海马病理变化,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(CORT)水平;免疫组化(IHC)检测海马BDNF、TrkB表达情况,蛋白质免疫印迹法(Western Blot)及实时荧光定量-聚合酶链式反应(PCR)测定海马BDNF、TrkB、CREB蛋白及mRNA的表达。结果:与空白组比较,模型组血清CRH、ACTH和CORT含量上升(P<0.01),海马病理损伤严重,海马BDNF、TrkB平均光密度降低(P<0.01),BDNF、TrkB、CREB蛋白及mRNA明显下降(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,针刺组血清CRH、ACTH、CORT含量下降(P<0.05),海马病理损害明显减轻,BDNF、TrkB平均光密度明显增加(P<0.05),BDNF、CREB、TrkB蛋白及mRNA表达水平上升(P<0.05)。结论:腧穴“解郁方”可能通过调节HPA轴和调控BDNF/TrkB/CREB信号通路,改善CUMS诱导的大鼠抑郁样行为。

电针“风池”“四神聪”介导NMDAR/CREB/BDNF信号通路改善血管性痴呆大鼠的学习记忆障碍

目的:观察电针“风池”“四神聪”对血管性痴呆(VD)大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)/环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)/脑源性神经营养因子(BDNF)信号通路及海马区钙超载所致兴奋性毒性的影响,探究电针“风池”“四神聪”改善大鼠学习记忆障碍的作用机制。方法:选用SPF级雄性SD大鼠32只,随机分为正常组(6只)、假手术组(6只)和手术组(20只)。手术组采用改良的Pulsinelli四血管阻断(4-VO)法制备VD模型,将造模成功的12只大鼠随机分为模型组和电针组,每组6只。电针组于双侧“风池”及左右“四神聪”进行电针干预,予连续波,频率2 Hz,电流1 mA,以大鼠头部微颤为宜。电针干预每日1次,每次30 min,持续21d。Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力;HE染色观察大鼠海马CA1区神经元形态;比色法检测大鼠血清、海马组织谷氨酸(GLU)含量及海马组织Ca^(2+)-三磷酸腺苷(ATP)酶活力;免疫组化法检测大鼠海马CA1区NMDAR、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca MKⅡ)、磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(p-Ca MKⅡ)、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(p-CREB)、CREB、BDNF蛋白表达;Western blot法检测大鼠海马组织NMDAR、CREB、p-CREB、BDNF蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期延长、穿越平台次数减少(P<0.01);海马神经元结构不同程度受损,海马CA1区组织结构疏松,排列结构散乱,网格状结构明显,神经元形态不规则,核仁固缩甚至溶解,胶质细胞增多,毛细血管扩张,散见炎性细胞浸润;血清及海马组织GLU含量、海马组织NMDAR蛋白表达升高(P<0.01),海马组织Ca^(2+)-ATP酶活力及Ca MKⅡ、p-Ca MKⅡ、CREB、p-CREB、BDNF蛋白表达水平降低(P<0.01,P<0.05),p-CaMKⅡ/CaMKⅡ、p-CREB/CREB值降低(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠逃避潜伏期缩短、穿越平台次数增加(P<0.01);大鼠海马CA1区组织排列散乱程度稍有好转,神经元形态相对完整,核仁形态相对明显,固缩或溶解现象减轻,胶质细胞数量相对减少,毛细血管扩张程度减轻;血清及海马组织GLU含量、海马组织NMDAR蛋白降低(P<0.01),海马组织Ca^(2+)-ATP酶活力及Ca MKⅡ、p-Ca MKⅡ、CREB、p-CREB、BDNF蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),p-Ca MKⅡ/CaMKⅡ、p-CREB/CREB值升高(P<0.05)。结论:电针“风池”“四神聪”可以改善VD大鼠学习记忆功能障碍,其机制可能通过降低海马组织GLU含量,抑制海马神经元兴奋性毒性,介导NMDAR/CREB/BDNF信号通路相关蛋白表达,维持神经细胞存活和生长有关。

孕中期母鼠丙泊酚麻醉手术对子代学习记忆的影响

探讨丙泊酚暴露引起的大鼠子代学习和记忆的影响。方法:36只成年清洁级SD雌性大鼠和12只雄性大鼠随机分成12组,每组3只雌鼠1只雄鼠。雌鼠怀孕14 d后随机分为2组对照组(n=18)、丙泊酚组(n=18),对照组:颈内静脉注射生理盐水2 ml/(kg.h);观察4小时;丙泊酚组:颈静脉注射1%的丙泊酚,按照2 ml/(kg.h)速度麻醉4 h。每组随机选12只血压、心率、血氧饱和度正常的孕鼠继续妊娠。对出生30 d的雄性子鼠行Morris水迷宫实验(MWM)(n=30)。于48 d处死各组子鼠取海马组织。蛋白免疫印迹法检测HDAC2、p-HDAC2、CREB、p-CREB、NR2B蛋白的表达。中性红染色法评估对照组及丙泊酚组海马组织神经元丢失。结果:与对照组比较,丙泊酚组子代大鼠的逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,海马区组织中的HDAC2和p-HDAC2的蛋白表达上调(P<0.05),而p-CREB和NR2B的蛋白表达下调(P<0.05),海马组织神经元缺失程度增加(均P<0.05)。结论:丙泊酚对孕中期大鼠的子代学习及记忆能力有影响,海马区HDAC2和p-HDAC2的蛋白表达上调,而p-CREB和NR2B蛋白下调,海马组织神经元缺失程度增加。