盾叶薯蓣环阿屯醇合酶基因克隆与表达(英文)

利用巢式PCR和RACE技术从盾叶薯蓣中克隆了阿屯醇合酶的cDNA(定名为DZCAS).结果表明,该cDNA的开放读码框为2280bp,编码759个氨基酸的多肽,分子量为86924Da,等电点为6.39.氨基酸序列比对表明盾叶薯蓣阿屯醇合酶与其他植物阿屯醇合酶的相似性超过70%,含有环阿屯醇合酶共有的保守序列.利用氧化鲨烯环化酶基因缺陷型酵母表达DZCAS,并用高效液相色谱和液质联用仪检测酵母细胞中环阿屯醇合成情况,证明DZCAS编码环阿屯醇合酶.RT-PCR分析表明,DZCAS在盾叶薯蓣幼叶中表达量最高,其次是在地下幼嫩块茎中,而地上幼茎表达量最低.

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。

黄独微型块茎环阿屯醇合酶基因克隆与序列分析

获取黄独皂苷合成途径关键酶环阿屯醇合酶(CAS)的基因全长cDNA序列,并进行序列分析。通过黄独微型块茎转录组数据库筛选得到CAS基因的核心片段,利用RT-PCR技术获得CAS基因保守片段,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得CAS基因的3′及5′末端序列,并采用生物信息学方法进行序列分析。结果表明,黄独微型块茎CAS基因编码序列长2 280 bp,编码814 bp的氨基酸序列,相对分子量为86 665.17 u,等电点为6.21。CAS蛋白主要是由α螺旋(33.66%)、延伸链(21.62%)以及无规则卷曲(44.72%)构成。CAS蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,三级结构为单体,含有CAS所必需的功能结构域,具有PLN03012多元结构域。CAS蛋白主要存在于质膜和内质网,可能为膜蛋白。黄独CAS蛋白与其他植物的CAS蛋白同源性较高,其中与菊叶薯蓣的CAS蛋白氨基酸相似性为96.05%。从黄独微型块茎中首次获得CAS基因cDNA全长序列,该基因具有CAS同源基因的典型特征。

盾叶薯蓣环阿屯醇合酶全长基因的克隆与分析

环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)是薯蓣皂甙元生物合成途径中的第一个关键酶。以基因组DNA为模板,利用染色体步行和长距离PCR方法首次克隆了盾叶薯蓣CAS全长基因。序列分析比较结果表明,盾叶薯蓣CAS全长基因为7192 bp,由18个外显子和17个内含子组成。外显子总长为2280 bp,编码759个氨基酸,最长的外显子为198 bp,最短的为47 bp;内含子总长4912 bp,最长的内含子为1551 bp,最短的为68 bp。Southern blot杂交分析表明,CAS基因在盾叶薯蓣基因组中为单拷贝。

葫芦巴环阿屯醇合酶基因的分离及其对薯蓣皂素合成的影响

以薯蓣皂素合成植物葫芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)为材料,从中分离了环阿屯醇合酶基因Tf CAS,并对其序列特征、基因的表达及其对葫芦巴薯蓣皂素生物合成的影响进行了分析。结果显示,该基因全长2271 bp,共编码756个氨基酸;其氨基酸序列与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)、豌豆(Pisum sativum L.)及百脉根(Lotus japonicus L.)环阿屯醇合酶氨基酸序列的同源性分别为94%、91%和89%。利用酵母表达系统对Tf CAS蛋白的生物化学功能进行了验证,结果表明该蛋白能够催化环阿屯醇的合成。进一步利用葫芦巴发根遗传转化体系在葫芦巴中过量表达Tf CAS基因,发现该基因的过量表达大幅提高了Tf CAS的表达,且促进了葫芦巴中β-谷甾醇和薯蓣皂素的生物合成,但与对照相比差异不显著。研究结果表明Tf CAS基因参与了葫芦巴薯蓣皂素的生物合成,但其并非为该合成途径中的限速酶。

罗汉果环阿屯醇合酶的同源建模、分子对接及催化环化的机理推测

环阿屯醇为植物甾醇类化合物,也是诸多甾醇类化合物生物合成的关键前体物质之一,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节胆固醇等多种药理活性。课题组前期克隆了罗汉果环阿屯醇合酶基因(Cycloartenol Synthase,CAS)并对其进行了功能验证(GenBank登录号:HQ128566)。但该酶的催化活性位点及催化机制尚不明确,阻碍了进一步的改造及应用。本研究利用同源建模预测CAS的三维结构,结合分子对接模拟技术分析该酶与底物的相互作用,结果表明,Asp491、Cys492、Cys570、Tyr540、His265是CAS酶上关键的催化位点,Asp491质子化2,3-氧化鲨烯引发四个环化反应形成C20正离子中间体,然后中间体经过一系列的碳正离子重排形成C11正离子中间体,最后通过His265与Tyr540去质子化使得C27与C11原子间形成单键生成产物环阿屯醇。此外,活性空腔内存在大量的疏水氨基酸,则通过疏水作用稳定反应物、中间体结合在活性空腔。该酶活性位点的发现,为今后通过定点突变技术改造酶的活性及调控代谢通路奠定了基础。

白芨环阿屯醇合酶基因BsCAS的克隆及序列分析

环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase, CAS)在植物甾醇和三萜类物质的合成途径中发挥重要调节作用,研究白芨环阿屯醇合酶BsCAS的序列信息,为进一步研究环阿屯醇合酶的功能奠定基础。基于白芨转录组数据,利用RT-PCR技术扩增BsCAS基因的CDS全长,通过生物信息学软件分析BsCAS蛋白的理化性质和结构特征,并进行氨基酸多序列比对分析与系统进化树分析。结果表明扩增获得的Bs CAS基因CDS全长为2 277 bp,编码758个氨基酸。BsCAS蛋白是无跨膜结构无信号肽的亲水性蛋白,BsCAS蛋白具典型的DCTAE结构域和QW结构域,属于氧化鲨烯环化酶超基因家族成员。BsCAS与铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的CAS蛋白具有很高的同源性,亲缘关系最近,并聚为一支。对白芨Bs CAS基因的克隆和序列特征分析为进一步阐明BsCAS基因在调控植物甾醇类物质合成途径中的功能提供数据支持。

刺五加环阿屯醇合酶基因的克隆及其表达分析

目的克隆刺五加的环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNAends,RACE)技术克隆刺五加CAS基因的全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过RT-PCR法检测CAS在不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果刺五加CAS基因的cDNA全长为2 758 bp,开放阅读框长2 277 bp,编码758个氨基酸的蛋白,包含三萜合成酶的标志性序列。CAS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中。RT-PCR的结果显示,刺五加CAS基因在各时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。其中果实基本成熟期的表达量最高,是最低量萌芽期的1.56倍,各器官中,叶片的表达量最高,是最低量叶柄的1.37倍。结论首次分离并报道了刺五加的CAS cDNA克隆,并证实其在不同生长发育时期和不同器官中的表达量不同,为进一步研究CAS对刺五加皂苷量的影响和表达调控奠定基础。

滇重楼环阿屯醇合酶基因的克隆及序列分析

目的获取滇重楼甾体皂苷合成途径关键酶环阿屯醇合酶基因(PpCAS)的全长cDNA序列,并进行序列分析。方法利用同源克隆和RT-PCR技术获得PpCAS基因保守片段,采用RACE技术获得PpCAS基因的3’及5’末端序列,并采用生物信息学方法进行序列分析。结果 PpCAS基因全长cDNA为2 309 bp,其开放阅读框(ORF)为2 283 bp,可编码760个氨基酸的蛋白质;PpCAS推导的蛋白质相对分子质量为8.69×104,等电点(pI)为6.54;其氨基酸序列与GenBank中其他植物CAS的同源性在60%～83%PpCAS蛋白。结论从滇重楼中首次获得PpCAS基因cDNA全长序列,该基因具有CAS同源基因的典型特征。

北柴胡环阿屯醇合酶基因的全长克隆与表达分析

环阿屯醇合酶(CAS)是柴胡中植物甾醇类物质合成途径的关键酶,与柴胡皂苷合成途径的关键酶基因β-香树酯醇合酶(β-AS)竞争共同的前体物质,影响柴胡皂苷的积累。为探究柴胡中环阿屯醇合酶的作用,本研究以北柴胡cDNA为模板,克隆获得北柴胡环阿屯醇合酶基因BcCAS的全长序列,对BcCAS全长cDNA序列及其编码氨基酸序列进行了生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测该基因在北柴胡不同组织中的表达差异。结果表明:该基因全长2314 bp(GenBank登录号:MT349674),包含2271 bp的开放阅读框,编码756个氨基酸。预测该基因的编码蛋白含有氧化鲨烯环化酶(OSC)超基因家族的DCTAE和QW结构域,与高氏柴胡、人参、光果甘草、白桦等植物的CAS蛋白具有较高同源性。BcCAS基因在北柴胡根、茎、叶、花等组织中均有表达,在茎中表达量最高。本研究为柴胡皂苷生物合成途径的调控研究提供帮助。

基于二代测序技术的黄芪萜类合成酶基因挖掘与生物信息学分析

目的:对黄芪萜类合成酶(TPS)基因进行挖掘与生物信息学分析,为黄芪萜类化合物特别是三萜皂苷的合成、积累作用及其分子机制研究奠定基础。方法:通过二代测序技术构建黄芪转录组文库,根据基因注释信息进行TPS序列初步筛选,BLAST同源比对确认。运用MEGA 4. 0构建邻接(NJ)系统进化树,采用在线工具开放阅读框(ORF) Finder,Compute p I/Mw,Prot Comp 9. 0进行生物信息学分析。结果:共获得76条TPS序列,其中13条拥有完整的ORF。获得的TPS序列中注释为TPS10序列最多,其次为大根香叶烯D合成酶和单萜合成酶;选取17条代表性TPS序列进行同源性分析,发现黄芪TPS序列分为3个类群,每一类群均包括Ⅰ型和Ⅱ型萜类合成酶序列。此外,挖掘得3条环阿屯醇合酶(CAS)序列,其中原始编号为CL6827. Contig1和Unigene19112的CAS序列具有完整的ORF,所编码蛋白质序列长度分别为795,757个氨基酸,亚细胞定位于内质网,与已报道黄芪CAS序列同源性最高。结论:利用黄芪转录组文库成功挖掘得黄芪单萜、倍半萜及三萜合成环化酶基因,定位于内质网的CAS序列与三萜皂苷主要由细胞质中的甲羟戊酸途径合成特征吻合。

多花黄精甾体皂苷生物合成途径分析及关键酶基因研究

甾体皂苷是黄精属植物的特征性成分及主要活性成分,黄精属甾体皂苷具有调节血糖、防治心脑血管疾病及抗肿瘤等多种药理活性。为解析黄精甾体皂苷生物合成途径,探究其关键酶基因,该研究使用BGISEQ-500平台对多花黄精的花、叶、根和根茎进行转录组测序,获得129989条unigenes,88958条unigenes被七大数据库注释,其中22813条unigenes可归类于53个GO功能分类中,64877条unigenes涉及136条KEGG代谢通路。502条unigenes涉及多花黄精甾体皂苷生物合成途径,其中97条unigenes编码甾体皂苷生物合成途径12个关键酶。对甾醇生物合成过程中的第一个关键酶环阿屯醇合酶进行序列分析和同源建模发现其具有保守的催化结构域和底物结合结构域。将多花黄精根茎与花、叶、根的基因表达水平比较,有2437条unigenes在根茎中特异性高表达且被KEGG注释,其中35条与甾体皂苷生物合成途径相关。该研究极大地丰富了黄精属植物的转录组数据,为植物甾体皂苷生物合成途径的解析提供了线索,为进一步研究甾体皂苷生物合成途径关键酶的功能及调控机制奠定了基础。

三七中由RNAi介导的CAS基因沉默对三七皂苷含量的影响

三七总皂苷为三七主要的药用活性成分,但因其产量较低,使其药用价值很难得到推广。三七皂苷和甾醇分别经达玛烯二醇合酶(DS)和环阿屯醇合酶(CAS)的催化共同的前体物质2,3-氧化鲨烯生成。利用Gateway技术建立了CAS基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,并利用农杆菌介导法将其转移并整合至三七基因组中,由此方法抑制CAS的表达,阻断植物甾醇的合成,间接增加三七皂苷的产量。