山羊环鸟苷酸-腺苷酸合成酶的原核表达及其酶活性分析

为了研究山羊环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(gcGAS)的生物学功能,通过构建含gcGAS基因的pET28a-gcGAS原核表达载体,在Rosetta(DE3)表达菌中进行表达,经纯化获得了纯度较高的重组gcGAS蛋白,并测定其酶促活性。结果显示,在优化表达条件下,实现了重组gcGAS蛋白的可溶性表达,其能以ATP和GTP为底物合成了第二信使分子2′3′-c GAMP。结论:原核表达的可溶性重组gcGAS蛋白具有生物酶催化活性,这为后续gcGAS介导的抗病毒天然免疫机制研究及其应用开发奠定了一定的基础。

DNA聚合酶η小分子抑制剂筛选

DNA损伤修复以及基因组稳定性维持对于动植物正常生长和防御逆境至关重要。针对DNA聚合酶错误掺入导致的基因组不稳定性,本研究以DNA聚合酶η为研究对象,通过计算分子模拟对接的方式,对其可能的小分子抑制剂进行筛选,并对其酶动力学参数进行测定。结果显示:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate,d ATP)对DNA聚合酶η的活性具有抑制效果,使其延伸的相对效率为36%~42%。分子模拟对接和体外实验结果表明,相较于dATP(亲和力为-26.7 kJ/mol),环鸟苷酸-腺苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP)与DNA聚合酶η具有更低的结合能(亲和力为-35.1 kJ/mol)。酶动力学参数测定结果也表明,相较于dATP,cGAMP具有更强的抑制能力且在浓度为0.5 mmol/L时达到最强(相对延伸效率为13%)。因此,本研究筛选获得了针对DNA聚合酶η的一种潜在的小分子抑制剂。同时,鉴于该蛋白质高表达导致细胞对抗肿瘤药物(DNA损伤剂)的耐受性,这为新型药物的开发提供了依据。

LC-MS/MS法测定环鸟苷酸-腺苷酸的方法学建立及其应用

目的建立LC-MS/MS方法检测环鸟苷酸-腺苷酸(cGAMP)含量。方法选用程序梯度法,色谱柱为PC HILLIC色谱柱(2.0 mm×150.0 mm,5μm),流动相A为10 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%甲酸),流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液,流速为0.4 ml/min,柱温为30℃,进样量为10μl。质谱优化条件:多反应监测(mμltiple reaction monitoring,MRM)模式,cGAMP[M+H]+为675.22,锥孔电压56 V,碰撞能量为20 eV。结果cGAMP在1~1000 ng/ml浓度范围内线性关系良好(n=9,r2=0.9999);方法定量限为1 ng/ml,批间/批内精密度均<20%,批间准确度为83%~96%,批内准确度87%~95%;方法提取回收率为80%~90%,基质效应<10%。结论该检测方法简单、快速、灵敏、准确,适用于细胞或体外cGAS酶合成cGAMP定量分析。

8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用和机制

目的:探讨在顺铂诱导的急性肾损伤(AKI)中8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(OGG1)的作用及机制。方法:48只8~10周龄C57BL/6雄性小鼠构建动物模型。24只分为4组,每组6只,分别经腹注射顺铂干预0 h、24 h、48 h和72 h。剩余小鼠也随机分为4组,即生理盐水对照组、顺铂组、OGG1抑制剂组(Th5487组)和顺铂+Th5487组。分别在腹腔注射生理盐水或顺铂和Th5487。留取血液测定肌酐、尿素氮,取肾组织进行病理分析,检测肾组织8-氧代鸟嘌呤含量和超氧化物歧化酶活力,RT-qPCR测定mRNA水平,Western Blot验证OGG1和炎症蛋白表达情况。利用顺铂诱导小鼠肾小管上皮细胞建立体外模型,检测线粒体膜电位改变、活性氧生成情况和蛋白表达变化。结果:在顺铂诱导的AKI模型中,OGG1表达上调,环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子(cGAS-STING)信号轴及炎症反应激活;Th5487可抑制顺铂诱导的组织损伤、cGAS-STING信号轴的激活及炎性反应;在体外,Th5487可减少顺铂诱导的细胞中ROS含量升高及线粒体膜去极化。结论:在顺铂诱导的AKI过程中,OGG1可通过cGAS-STING信号促进肾脏损伤及炎症反应。

腺苷酸环化酶及蛋白激酶A在β受体激动增加eNOS活性信号通路中的作用

目的阐明β受体激动增加内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性信号通路中腺苷酸环化酶(AC)及蛋白激酶A(PKA)的作用。方法体外培养人脐静脉内皮细胞;运用同位素两步色谱法([3H]-L-精氨酸转化法)检测eNOS活性。本研究设置空白对照组、AC组和PKA组,每组因素下再分ISO及BSS两个干预因素组,观察AC特异性阻断剂SQ-2256(5×10-5mol/L)及PKA特异性阻断剂H-89(1×10-7mol/L)分别与人脐静脉内皮细胞孵育10min,再与异丙肾上腺素(ISO)孵育30min后eNOS活性变化。结果ISO明显增加eNOS活性(30.7±3.9)%,P<0.01;分别阻断AC、PKA,ISO诱导的eNOS活性增加均受到抑制(12.1±3.53)%、(4.73±2.19)%,P<0.01。结论ISO激活eNOS活性的信号通路上,AC和PKA均有参与。

吗啡依赖相关的酶学研究进展

吗啡依赖形成的机制是一个复杂的过程。涉及特定脑区突触超微结构变化、神经递质、酶学等多种复杂的机制,并且相互之间有密切的联系。本文从蛋白激酶类、一氧化氮合酶、超氧化物歧化酶、腺苷酸环化酶、琥珀酸脱氢酶、3β-羟基类固醇脱氢酶等几方面对吗啡依赖相关酶体系的研究进展作一综合性论述。

白头翁皂苷D介导AMPK/COX-2通路对食管癌细胞增殖、凋亡的影响

目的 探讨白头翁皂苷D调控腺苷酸活化蛋白激酶/环氧合酶-2(AMPK/COX-2)信号通路对人食管癌细胞EC9706增殖及凋亡的影响。方法 体外培养EC9706细胞,不同浓度梯度白头翁皂苷D处理后,MTT法检测EC9706细胞增殖,以筛选白头翁皂苷D的作用浓度。将EC9706细胞分为对照组,白头翁皂苷D(PSD)低、中、高剂量组(10、20、40μmol/L白头翁皂苷D),PSD高剂量+AMPK抑制剂(Compound C)组(40μmol/L白头翁皂苷D+10μmol/L Compound C),平板克隆形成实验检测EC9706细胞增殖;流式细胞术检测EC9706细胞凋亡;Western blot法检测EC9706细胞Bax、Bcl-2、p53、磷酸化AMPK(p-AMPK)、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(p-ACC)、COX-2蛋白表达水平。结果 与对照组比较,PSD低、中、高剂量组EC9706细胞克隆形成率、Bcl-2、COX-2蛋白表达水平显著降低,细胞凋亡率、Bax、p53、p-AMPKα、p-ACC蛋白表达水平显著升高,并呈浓度依赖性(P<0.05);与PSD高剂量组比较,PSD高剂量+Compound C组细胞克隆形成率、Bcl-2、COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率、Bax、p53、p-AMPKα、p-ACC蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论 白头翁皂苷D通过激活AMPK途径抑制COX-2表达,进而抑制EC9706细胞增殖,促进细胞凋亡。

阴茎勃起相关基因的研究进展

勃起功能障碍 (ED)的分子生物学研究近 10年来已取得了较大的进展 ,阴茎勃起是在神经内分泌调节下的阴茎动脉 ,阴茎海绵体及阴茎静脉回流等一系列血流动力学的变化过程。在阴茎海绵体平滑肌松弛过程中 ,一氧化氮 3’,5 ’ 单磷酸环鸟苷酸 (NO cGMP)通路起着重要的调控作用 ,对与勃起有关的一氧化氮合酶 (NOS)、磷酸二酯酶(PDEs)、K+ 通道、胰岛素样生长因子 (IGF)、血红素氧合酶 (HO)、血管内皮生长因子 (VEGF)、cGMP依赖性激酶Ⅰ (cGKⅠ )、血管紧张素转换酶 (ACE)、生长因子 (GF)等相关基因的深入研究 。

运动应激介导线粒体DAMP对先天性免疫的调控作用研究进展

线粒体是先天性免疫的关键调控者,具体表现为:线粒体可以通过释放多种线粒体损伤相关分子模式(damageassociated molecular patterns,DAMPs)来诱发先天性免疫应答,如线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)、线粒体N-甲酰肽(mitochondrial N-formyl peptides,F-MITs)、ATP等.然而,病毒也利用相应的机制抑制线粒体DAMPs诱导的先天性免疫.众所周知,适度的运动对机体免疫系统有着积极健康的影响,而大强度运动反之.再者,运动又与线粒体的关系密切.因此,运动很可能通过线粒体DAMPs的释放来调控先天性免疫.本文综述了线粒体DAMPs与先天性免疫的联系,并探讨了运动在其中所扮演的角色,以期从线粒体的视角为运动对先天性免疫的调控机制提供新的研究思路.

番茄碱通过AMPK/COX-2通路调控食管癌细胞凋亡的机制研究

目的探究番茄碱通过单磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/环氧合酶-2(COX-2)通路抑制食管癌凋亡的机制研究。方法将人食管癌EC9706细胞随机分为对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+抑制药组;对照组细胞不做处理,低、中、高剂量实验组细胞分别给予1.0、2.0和4.0μmol·L^(-1)的番茄碱处理细胞48 h,高剂量+抑制药组使用4.0μmol·L^(-1)番茄碱和10μmol·L^(-1)AMPK抑制药Dorsomorphin共同处理细胞48 h。用细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测细胞存活率;用流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡情况;用蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞相关蛋白表达情况。结果对照组,低、中、高剂量实验组及高剂量+抑制药组细胞TUNEL阳性细胞率分别为(3.73±0.60)%、(12.48±1.05)%、(17.03±1.29)%、(33.04±2.25)%和(13.99±1.12)%,Ki67蛋白表达水平分别为0.98±0.09、0.79±0.07、0.59±0.09、0.33±0.03和0.71±0.07,胱天蛋白酶(Cl-caspase-3)蛋白表达水平分别为0.30±0.04、0.59±0.05、0.75±0.07、1.00±0.06和0.54±0.05,p-AMPK蛋白表达水平分别为0.28±0.05、0.56±0.06、0.73±0.04、1.09±0.10和0.69±0.04;COX-2蛋白表达水平分别为1.13±0.08、0.74±0.07、0.57±0.07、0.39±0.04和0.72±0.07。低、中、高剂量实验组上述指标与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);高剂量+抑制药组上述指标与高剂量实验组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论番茄碱可通过激活AMPK/COX-2信号通路抑制食管癌细胞增殖、诱导凋亡。

亮丙瑞林调控AMPK/COX-2通路对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的探究亮丙瑞林对子宫肌瘤细胞增殖和凋亡及单磷酸腺苷酸活化蛋白激酶/环氧合酶-2(AMPK/COX-2)通路的影响。方法体外培养子宫肌瘤细胞,将其分为:对照组、亮丙瑞林低剂量组、亮丙瑞林中剂量组、亮丙瑞林高剂量组、高剂量+抑制剂组。噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活力;AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡情况;免疫印迹(WesternBlot)检测Bcl-2相关蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、磷酸化AMPK(p-AMPK)、AMPK、COX-2的表达。结果与对照组相比,亮丙瑞林低、中、高剂量组细胞增殖活力呈现下调趋势;凋亡率呈现上调趋势(P<0.05);细胞中Bax、Caspase-3与p-AMPK/AMPK蛋白表达升高,Bcl-2与COX-2蛋白表达降低,且均呈浓度依赖性(P<0.05)。与亮丙瑞林高剂量组相比,高剂量+抑制剂组细胞增殖活力、细胞中Bcl-2与COX-2蛋白表达升高,而凋亡率、细胞中Bax、Caspase-3与p-AMPK/AMPK蛋白表达降低(P<0.05)。结论亮丙瑞林可能通过激活AMPK/COX-2通路抑制子宫肌瘤细胞增殖,促进细胞凋亡。

四味黄芪散降低低氧性肺动脉高压的机制研究

目的探讨低氧不同时相内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路参与藏药四味黄芪散降低低氧性肺动脉高压的机制。方法将110只SD大鼠随机分为常氧组、低氧对照组和低氧药物组,后两组根据暴露低氧时间又各分为5个组。常氧组大鼠暴露于西宁地区(海拔2260 m)大气环境,正常喂养;10个低氧组置于模拟海拔5000 m的低压氧舱,其中,5个低氧药物组灌胃给予四味黄芪散混悬液,5个低氧对照组灌胃给予生理盐水,每日1次,持续30 d。分别于暴露低氧第1、3、7、15、30天时测定肺动脉压(PAP)、左右心室比值;并采集肺组织标本,用WB法测定肺组织中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、eNOS、内皮素1(ET-1)蛋白的含量。结果与常氧组比较,低氧对照组大鼠的PAP和左右心室比值逐渐增高,于暴露低氧第7天起显著升高,并随暴露低氧时间的进一步延长而持续增高;低氧药物组大鼠的PAP也随暴露低氧时间的延长而增高,但其增高幅度明显低于低氧对照组。低氧药物组大鼠肺组织eNOS蛋白的水平在急性低氧15 d内均低于常氧组和低氧对照组;于低氧第15天后,低氧药物组eNOS蛋白的水平逐渐升高,超过低氧对照组,于低氧30 d时显著增高,甚至超过常氧组水平。低氧下,eNOS蛋白水平的表达趋势与肺组织中AMPK蛋白及Beclin-1的水平呈高度相关。低氧对照组大鼠肺组织中ET-1蛋白的水平随暴露低氧时间的延长而增高,于低氧第7天时达峰值;低氧药物组大鼠肺组织中ET-1的水平无论在急性低氧期或慢性低氧期均显著低于低氧对照组。结论eNOS蛋白在不同低氧时相呈现不同的水平,四味黄芪散降低低氧性肺动脉高压的机制也不同。急性低氧期主要通过下调ET-1的水平来降低PAP;慢性低氧期主要通过上调eNOS的水平及调控AMPK-eNOS信号通路,抑制平滑肌细胞增殖,降低PAP。