蛋白质翻译后修饰对环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶功能的调控

环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子信号通路是细胞感知细胞质中异常存在的双链DNA的主要效应器,对于该信号通路的调节,可以通过调控细胞质内DNA识别受体环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶的功能来完成。近年来研究发现,蛋白质翻译后修饰,包括磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化、类泛素修饰等在固有免疫信号通路的调节中具有重要功能。本文就蛋白质翻译后修饰如何通过不同的机制对环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶的功能及其下游的信号通路产生多种多样的影响进行阐述。

环状GMP-AMP合成酶高表达对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响

目的:探讨环状GMP-AMP合成酶(cGAS)高表达对乳腺癌MCF7细胞发生上皮间质转化(EMT)的影响。方法:构建稳定高表达cGAS的慢病毒载体并转染MCF7细胞;转染后细胞分别培养12 h,24 h,48 h,72 h,每组实验重复三次,采用MTT检测cGAS对MCF7细胞增殖的影响;transwell法检测高表达cGAS对MCF7细胞迁移能力的影响;蛋白免疫印迹(Western blot)法分析EMT相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达情况。结果:与对照组比较,cGAS上调后MCF7细胞增殖能力显著增强(P<0.05);细胞形态学观察显示cGAS上调后诱导MCF7细胞EMT发生,细胞形态由鹅卵石样变为梭形;transwell实验结果显示,cGAS上调导致MCF7细胞迁移能力增强(P<0.05);Western blot结果表明,cGAS上调后上皮标记蛋白E-cadherin表达下降(P<0.05),间质标记蛋白N-cadherin表达增加(P<0.05)。结论:cGAS上调可增强乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,诱导乳腺癌细胞EMT发生。

环磷酸鸟苷-腺苷合成酶和干扰素基因刺激因子信号通路与缺血性脑卒中相关性的研究进展

缺血性脑卒中(IS)是一种常见的神经系统损伤疾病,其特征是局部脑血流暂时或永久减少,其高发病率、高致残率和不良预后给社会带来了沉重负担[1]。迄今为止,治疗急性IS的方法主要是静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂,然而由于重组组织型纤溶酶原激活剂的治疗窗口狭窄,只有少数患者接受溶栓治疗.

DNA损伤应答中环状GMP-AMP合成酶的UFMylation修饰潜在作用

为探究环状GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthetase,cGAS)翻译后修饰参与DNA损伤应答的潜在作用,转染HeLa细胞和HEK-293T细胞,设置未处理组和Etoposide处理组。基于Western blot和免疫荧光染色,确定HeLa细胞质粒转染效率、Etoposide处理前后的DNA损伤效果、DNA损伤前后cGAS的细胞定位情况。采用免疫共沉淀和Western blot检测HEK-293T细胞cGAS的表达及UFMylation修饰。实验结果显示,HeLa细胞稳定表达cGAS,Etoposide处理可造成明显DNA损伤,未处理组cGAS富集于细胞质,处理组cGAS富集于细胞核。HEK-293T细胞稳定表达转染质粒,同时发现UFMylation修饰的cGAS。因此,cGAS参与DNA损伤应答且可能通过UFMylation修饰调控,为翻译后修饰视角研究DNA损伤应答提供理论参考。

白桦环阿齐醇合成酶(CAS)基因与达玛烯二醇合成酶(DS)基因的双基因RNA干扰载体构建

环阿齐醇合成酶(Cycloartenol synthase,CAS)和达玛烯二醇合成酶(Dammarenediol synthase,DS)为白桦三萜合成过程分支途径关键酶基因,对CAS和DS基因的抑制或沉默将有利于三萜前体-2,3氧化角鲨烯向目标产物白桦脂醇和齐墩果酸合成。利用同源序列PCR方法及pRNAi-GG新型载体,进行DS单基因RNAi及DS与CAS双基因RNAi载体的构建。结果显示,分别克隆获得CAS和DS c DNA序列长度为300和509 bp,Blast同源序列比对与已知日本白桦BPX1和OSCBPD相似度为100%和92%。依据基因RNAi引物设计及pRNAi-GG使用原则,分别将CAS、DS的正向片段和反向片段有序地连接到pRNAi-GG载体PDK内含子两侧,并转化大肠杆菌Trans1-T1中,经PCR及克隆测序验证,获得白桦DS单基因和CAS、DS双基因干扰载体,并通过三亲杂交方法分别获得含有两个RNAi载体的工程农杆菌菌株。该研究为进一步通过基因工程手段阻断白桦三萜分支途径及促进前体物质向目标产物白桦酯醇和齐墩果酸方向合成奠定了基础。

特异切割番茄1-氨基环丙烷羧酸合成酶mRNA的核酶基因序列的合成与克隆

根据番茄１－氨基环丙烷羧酸合成酶（ＡＣＣ合成酶）基因ｃＤＮＡ序列，按照锤头状核酶作用模式，设计合成长度分别为４０ｍｅｒ和４８ｍｅｒ的一对引物，经体外退火、延伸、连接，插入质粒ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）的ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ位点之间，经菌落原位杂交、双酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳和序列分析证明，人工合成了特异切割ＡＣＣ合成酶ｍＲＮＡ第６６７～６６９位点ＧＵＣ序列的核酶基因序列。

缺氧对肺动脉内皮细胞环氧合酶，血栓素合成酶基因表达的影响

应用分子杂交技术和放射免疫检测方法研究了缺氧对猪肺动脉内皮细胞的环氧合酶（ＣＯＸ）和血栓素合成酶（ＴＸＳ）基因表达及其条件培养基中６ｋｅｔｏＰＧＦ１α和ＴＸＢ２含量的动态变化。发现：６，１２，２４和４８ｈ缺氧组分别与常氧组比，ＣＯＸ１和ＣＯＸ２基因表达增加，并且ＣＯＸ２ｍＲＮＡ在缺氧６和１２ｈ就明显表达增加。在前述的不同缺氧时间组内皮细胞条件培养基中６ｋｅｔｏＰＧＦ１α含量也均显著高于相应常氧对照组（Ｐ＜０．０５）；但ＴＸＳ的ｍＲＮＡ水平及ＴＸＢ２含量在缺氧４８ｈ才有明显增加（Ｐ＜０．０５）。结果表明：（１）缺氧可诱导肺动脉内皮ＣＯＸ基因表达和ＰＧＩ２生成增加，在早期以ＣＯＸ２基因表达增加更为明显，提示可能在肺血管缺氧反应中起调节作用。（２）４８ｈ的缺氧可使内皮细胞ＴＸＳ基因表达及ＴＸＡ２生成增加，它可能在慢性缺氧肺血管反应中起介导作用。

基于环磷酸鸟苷-腺苷合成酶/膜蛋白干扰素基因刺激因子通路探讨奥拉西坦对脑出血大鼠神经功能的影响

目的从环磷酸鸟苷-腺苷合成酶(cGAS)/膜蛋白干扰素基因刺激因子(STING)通路方面,探讨奥拉西坦(ORC)对脑出血大鼠认知功能的影响。方法将SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、ORC组(50 mg/kg)、RU.521组(cGAS抑制剂,50 mg/kg)、DMXAA组(STING激活剂,25 mg/kg)、ORC+DMXAA组,每组15只。用Longa法测大鼠神经功能变化;干湿比重法测脑含水量;电镜测血肿周围病理变化;铁染色法测血肿周围组织铁沉积,以评估血肿程度;TUNEL法测血肿周围组织神经元凋亡状况;免疫组化法测血肿周围组织cGAS阳性表达。Western blotting法测STING、TNF-α、IL-12、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase3)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、转铁蛋白(Tf)、转铁蛋白受体(Tf R)、水通道蛋白4(APQ4)蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠死亡、偏瘫及侧旋转等神经功能缺损行为评分明显升高,血肿周围组织神经元水肿及凋亡明显增加,脑水肿、铁沉积严重,cGAS/STING通路蛋白及其介导的炎症反应和促凋亡途径激活(均P<0.05)。ORC组及RU.521组大鼠神经功能缺损评分明显降低、血肿周围组织神经元损伤、凋亡、脑水肿及铁沉积均明显缓解,cGAS/STING通路蛋白及其介导的炎症反应和促凋亡相关蛋白表达明显降低(均P<0.05)。DMXAA可逆转ORC的上述作用(P<0.05)。结论ORC可能通过抑制cGAS/STING通路活化,缓解脑出血大鼠血肿周围神经元炎症损伤及凋亡,减轻神经功能缺损。

干扰环阿乔醇合成酶基因的表达对人参皂苷含量的影响

通过RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)调控人参发根中环阿乔醇合成酶(CS)的表达,实现了在分子水平上对人参皂苷合成途径进行调控,并获得了人参总皂苷含量提高82.17%的可遗传人参发根系。同时,证明了RNAi可成功调控植物次生代谢产物。

黄河蜜甜瓜1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶基因片段的克隆和反义载体的构建

从伤诱导的黄河蜜甜瓜(Cucumismelocv.Huanghemi)成熟果实的中果皮组织中分离总RNA,经反转录和PCR扩增得到974bp的cDNA片段,克隆到质粒载体pGEM-3zf,经测序与Genbank中甜瓜1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶(1-amino-cyclopropane-1-carboxylieacidsynthase,ACS)基因同源性为99%。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121的35S启动子和NOS终止子之间,构建成ACS基因的反义表达载体。

细菌感染影响牙周组织细胞表达环鸟苷-腺苷合成酶的实验研究

目的研究侵入牙周组织细胞内的细菌对细胞表达环鸟苷-腺苷合成酶(c GAS)的影响。方法将SYTO9标记的牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)以感染复数(MOI)为10与人牙周膜细胞(hPDLCs)共培养24 h后,使用激光共聚焦显微镜观察P.gingivalis对hPDLCs的侵袭情况,并应用荧光标记活细胞筛选(FACS)分选出被P.gingivalis入侵的hPDLCs,利用实时定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)和Western blot对hPDLCs中c GAS的表达变化进行检测。此外还利用免疫组织化学技术对细菌感染性牙龈组织和正常牙龈组织中c GAS表达定位和表达水平变化进行分析。结果激光共聚焦显微镜下观察,P.gingivalis和hPDLCs共培养24 h后,几乎所有的细胞内都可观察到绿色荧光;被P.gingivalis感染的hPDLCs中c GAS表达水平明显上调;在牙龈组织中c GAS主要在上皮细胞和上皮下组织中的炎性细胞中表达;且细菌感染性的牙龈组织中c GAS的表达水平明显高于正常牙龈组织。结论侵入hPDLCs内的活体P.gingivalis,可以明显上调细胞中c GAS的表达;且在细菌感染的炎性牙龈组织中c GAS的表达也明显升高。该结果提示c GAS可能参与了牙周组织细胞中细菌来源的病原ds DNA的识别。

足月妊娠子宫蜕膜组织环氧化酶Ⅱ与前列腺素E合成酶2的表达与引产成功率的关系

目的研究足月妊娠人子宫蜕膜组织中环氧化酶Ⅱ(COXⅡ)与前列腺素E合成酶2(PTGES2)蛋白的表达与缩宫素引产成功率的关系。方法选择缩宫素引产成功与缩宫素引产失败的孕妇,于剖宫产术中取子宫蜕膜组织。行Western blot检测子宫蜕膜中COXⅡ与PTGES2蛋白的表达。结果缩宫素引产成功组与引产失败组子宫蜕膜组织COXⅡ蛋白的表达水平无明显差异。缩宫素引产成功组比引产失败组子宫蜕膜PTGES2蛋白的表达明显增高(P<0.05)。结论子宫蜕膜组织中PTGES2蛋白的表达量与缩宫素引产成功率关系密切。

缺氧诱导因子-1α、诱导型一氧化氮合成酶及环氧合酶-2在慢性高眼压大鼠视网膜中的表达

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)的表达与高眼压视网膜损伤的关系,为青光眼视网膜缺氧提供证据。方法用巩膜静脉烧烙法在50只SPF级Wistar大鼠的双眼制作慢性高眼压模型,眼压高于造模前40%以上者为造模成功。按照视网膜取材时间的不同将动物模型眼随机分为高眼压3、7、14、21、28 d组,每组10只大鼠20只眼。另选取10只匹配大鼠作为假手术对照组,仅作球结膜切开。应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法及Western blot法检测各组视网膜组织中HIF-1α、iNOS、COX-2 mRNA及其蛋白在大鼠视网膜中的表达。结果 HIF-1α、iNOS、COX-2 mRNA及蛋白在假手术组大鼠视网膜中呈微弱表达,造模眼HIF-1α、iNOS、COX-2 mRNA及其蛋白在视网膜中的表达水平明显升高,于7 d时达到高峰,随后有所下降,但仍明显高于正常组的表达水平。造模后3、7、14、21、28 d组大鼠视网膜中HIF-1α、iNOS、COX-2 mRNA及其蛋白的表达与假手术组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 HIF-1α、iNOS、COX-2的低氧信号途径是青光眼神经变性发生发展中重要的病理生理机制。

缺氧对冠状动脉内皮及平滑肌细胞环氧合酶和血栓素A_2合成酶基因表达的影响

用放免及斑点杂交法研究缺氧对培养的冠状动脉内皮细胞（CAEC）和平滑肌细胞（CASMC）的环氧合酶（COX）和血栓素A2合成酶（TxS）基因表达的影响。实验表明在缺氧时，CAEC和CASMC中COX-1表达增加，总光密度比常氧对照组分别高3倍和1．8倍；COX-2及TXS表达无明显变化。CAEC及CASMC条件培养液中6-ketc-PGF1a含量明显升高，而TxB2与对照组无明显差异。结果提示，缺氧致冠状动脉舒张反应中可能有内皮和平滑肌细胞COX-1基因表达及PGI2生成增多的作用。

环颈雉肝脏脂肪酸合成酶活性的研究

对环颈雉肝脏脂肪酸合成酶类进行测试分析。结果表明,环颈雉肝脏的各种脂肪酸代谢酶类的活性表现为:84日龄的ACC、FAS及NADP-MDH的活性值比28日龄的显著增加。G-6-PDH的活性非常低,显示环颈雉的脂肪酸合成途径与鸡相同,脂肪酸的合成所需要的NADPH是由NADP-MDH参与的丙酮酸-苹果酸途径提供的。

体外循环缺血-再灌注对人心房肌细胞一氧化氮合成酶的影响

目的：探讨体外循环心脏缺血一再灌注对人心房肌一氧化氮合成酶的影响。方法：用免疫组织化学结合计算机图像分析技术，检测在心脏缺血一再灌注前后１１例病人心房肌肉一氧化氮合成酶的三种同功异构酶一神经性一氧化氮合成酶、诱导性一氧化氮合成酶和内应性一氧化氮合成酶含量的变化。结果：心脏缺血一再灌注后神经性一氧化氮合成酶反应产物的平均灰度值明显减少，内皮性一氧化氮合成酶者明显增加，而诱导性一氧化氮合成酶者无明显改变。结论：心脏缺血一再灌注引起人心房肌神经性一氧化氮合成酶表达增加、内皮性一氧化氮合成酶表达减少，而对诱导性一氧化氮合成酶无明显影响。心脏缺血一再灌注后心脏功能失调可能与心房肌以上变化有关。

贝母中环阿屯醇合成酶的生物信息学分析

目的:采用多种生物信息学手段,分析预测贝母中环阿屯醇合成酶的特征信息。方法:以浙贝母的环阿屯醇合成酶氨基酸序列为研究对象,利用Prot Param、Signal P、PSORT、Prot Scale、SOMPA、Predict Protein、PROSITE、COILS和SWISS-MODEL等在线预测工具,对其理化性质、亚细胞定位、亲疏水性、二级结构、三级结构等进行分析。结果:该酶由756个氨基酸残基构成,是一种无信号肽、无跨膜结构、定位于微体的可溶性亲水蛋白。α螺旋和无规则卷曲为主要的二级结构元件。三级结构以羊毛甾醇合成酶为模板建模,功能位点是萜类合酶位点,位于603~617 aa;结合配体为Zn^(2+),结合位点为676His、677Ala、678Val、679Asn、682Trp和723Ala。结论:生物信息学手段分析预测结果可靠性较高,为进一步研究贝母活性生物碱的生物合成调控机制奠定了理论基础。

滇牡丹环阿屯醇合成酶基因的克隆及表达分析

为研究环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase)基因在滇牡丹生物合成中的作用机制,该文采用RT-PCR技术首次从滇牡丹(Paeonia delavayi)中克隆得到一个具完整开放阅读框的环阿屯醇合成酶基因(PdCAS),该基因全长2274 bp,共编码757个氨基酸,PdCAS蛋白序列与桃(Prunus persica)、日本裸樱(Prunus yedoensis var.nudiflora)、葡萄(Vitis vinifera)蛋白序列相似性在86%以上。序列比对分析显示PdCAS具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和三萜合成酶的标志性序列DGSWYGSWGVCFTYG。滇牡丹PdCAS蛋白与蔷薇科植物苹果(Malus domestica XP 008391430.1)、白梨(Pyrus bretschneideri XP 009370034.1)、月季(Rosa chinensis XP 024193310.1)、日本裸樱(Prunus yedoensis var.nudiflora PQQ11009.1)、桃(Prunus persica XP 007225240.1)的CAS蛋白聚为一类。PdCAS基因在滇牡丹各组织中均有表达,但是在花瓣中表达量较高。该研究克隆的PdCAS基因与滇牡丹甾醇类化合物的合成密切相关。

茄科雷尔氏菌脂酰CoA脱饱和酶和环丙烷脂肪酸合成酶的鉴定

茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是一种危害严重的土传植物致病菌,其宿主范围广泛,在世界各地严重影响重要经济作物的生产.研究茄科雷尔氏菌的生理特性,探索其致病机理,有利于研发防治青枯病的技术与方法.脂肪酸是细菌细胞重要的组成物质,但是茄科雷尔氏菌脂肪酸合成的机制尚不清晰.本文以茄科雷尔氏菌GMI1000为材料,鉴定了该菌的脂酰Co A脱饱和酶和环丙烷脂肪酸合成酶,并分析了这两种酶在不饱和脂肪酸和环丙烷脂肪酸合成中的作用.结果显示,茄科雷尔氏菌RSc2450编码脂酰Co A脱饱和酶,参与其不饱和脂肪酸合成,但是该菌还存在其他不饱和脂肪酸合成途径.同时发现在茄科雷尔氏菌编码两个可能的环丙烷脂肪酸合成酶蛋白质中,仅有Cfa1(RSc0776)参与了该菌环丙烷脂肪酸的合成,并在低p H和高渗透压的耐受中起作用.该研究结果为深入研究茄科雷尔氏菌脂肪酸合成代谢特点及致病机理奠定了基础.

环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子信号通路与非感染性炎性疾病的相关性研究进展

作为胞质中的DNA感受器,环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cGAS)能够识别细胞质内的异常DNA,激活干扰素基因刺激因子(STING),影响机体的免疫反应。近年研究发现在非感染性炎性疾病中该通路可通过促进Ⅰ型干扰素和干扰素刺激基因的表达发挥作用。本文就cGAS-STING通路在多个系统的非感染性炎性疾病中的激活与调控及其对疾病的发生发展的影响进行综述,为其在非感染性炎性疾病相关的应用研究提供借鉴。