转基因大豆GTS40-3-2成分现场可视化检测方法的建立

转基因大豆GTS40-3-2转化体是种植面积最广的转基因大豆品种,根据GTS40-3-2转化体特异性序列设计引物,应用可视化环介导等温扩增技术,对其进行快速扩增及可视化判断;同时建立转基因成分人工污染的食品模型,比较了LAMP法与定性PCR方法检测的敏感性。结果表明:该方法仅对GTS40-3-2转化体产生特异性扩增,灵敏度高达0.001%。所建立的GTS40-3-2转化体特异性现场可视化筛查方法具有较高的特异性与灵敏性,操作简单、快速,可用于转基因大豆GTS40-3-2成分污染的现场可视化检测。

饲料中牛、羊源性成分现场可视化检测方法的建立

根据牛、羊线粒体中物种特异性序列设计引物,应用可视化环状等温扩增技术(visual loop-mediate isothermal amplification,vLAMP)对牛、羊源性成分进行快速扩增及可视化判断,同时建立牛、羊源成分人工污染的饲料模型,考察vLAMP检测方法的灵敏度。结果表明,牛源性引物和羊源性引物仅分别对牛、羊源性成分产生特异性扩增,灵敏度高达0.001%。本试验所建立的牛、羊源性成分现场可视化筛查方法具有较高的特异性与灵敏度,操作简单、快速,可用于饲料中牛、羊源性成分污染和食品掺伪的现场可视化检测。

化脓隐秘杆菌可视化LAMP检测方法的建立

为建立化脓隐秘杆菌(A.pyogenes)可视化LAMP检测方法,本研究根据A.pyogenes 16S rRNA基因的特异性保守核苷酸序列设计两对LAMP引物,通过反应体系和反应条件的优化,结果显示,本研究建立的LAMP方法的最佳反应条件为62℃反应70 min。利用建立的LAMP方法检测金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、A.pyogenes等山羊和绵羊常见的16种细菌的DNA样品,结果显示仅A.pyogenes DNA样品检测为阳性,其它细菌DNA样品和阴性对照检测均为阴性,表明该方法具有较强的特异性。利用建立的LAMP方法检测不同稀释度的重组质粒标准品pMD19T-Arc,结果显示检测限为8.2拷贝/μL,表明该方法具有较高的敏感性。利用建立的LAMP方法和普通PCR方法对128份山羊和绵羊皮下脓肿样品进行检测,结果显示两种方法对A.pyogenes的阳性检出率分别为18.8%(24/128)和17.2%(22/128),总符合率为98.4%(126/128)。结果表明,本研究首次建立了检测A.pyogenes的基于钙黄绿素指示剂的可视化LAMP方法,为山羊和绵羊A.pyogenes感染的检测提供了一种可视化快速的技术手段。

非洲马瘟病毒可视化RT-LAMP现场检测方法的建立

为建立非洲马瘟病毒(AHSV)可视化RT-LAMP检测方法,本研究根据AHSV外衣壳蛋白(VP7)基因保守序列设计2对特异性引物,通过反应条件优化建立了AHSV可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,本实验所建立RT-LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h;利用该方法检测进口灭活冻干疫苗中的9个血清型AHSV以及马流感病毒、马传贫病毒、马动脉炎病毒和蓝舌病病毒的RNA,结果显示所有血清型AHSV RNA检测均为阳性,其它病毒RNA检测为阴性,该方法特异性较强;该方法最低可检测到3.2×10-9 ng/μL的RNA,敏感性是普通RT-PCR方法的1000倍。利用建立的RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法对35份马血和5份驴血样品同时进行检测,结果显示二者阳性和阴性符合率均为100%。本研究在国内外首次建立了AHSV 9种血清型的可视化RT-LAMP检测方法,其具有特异性强、敏感性高、快速和高通量检测的优点,为非洲马瘟(AHS)快速的可视化现场诊断提供可行方法。

新冠病毒的现场可视化LAMP检测及其冷链食品分析应用

建立了一种基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)和核酸分子"光开关"[Ru(phen)_(2)dppz]^(2+)相结合的新型冠状病毒高灵敏可视化检测方法。分别采用保温杯代替实验室恒温装置,采用蓝光手电代替蓝光透射仪,实现了新冠病毒的现场快速可视化LAMP检测。针对新型冠状病毒N基因设计特异性序列引物,采用[Ru(phen)_(2)dppz]^(2+)分子光开关的特性检测LAMP扩增产物,结果可以借助蓝光手电直接通过肉眼观察是否出现红色荧光进行判定。该方法可检测到单个拷贝数的新型冠状病毒基因片段,并具有高度特异性,检验快速,整个过程仅需40min即可目视观察结果。对新冠病毒假病毒人工污染的模拟冷链食品进行检测,结果与目前新型冠状病毒检测金标准实时荧光定量PCR法吻合度为100%。该方法仅需保温杯和蓝光手电,可以作为实时荧光PCR方法的补充,为食品新冠病毒的现场筛查提供快速高效的技术支持。

伪结核棒状杆菌可视化LAMP现场检测方法的建立

为建立伪结核棒状杆菌可视化LAMP检测方法,根据伪结核棒状杆菌16S rRNA基因的特异性保守核苷酸序列设计2对引物,通过反应体系和反应条件的优化,建立了伪结核棒状杆菌可视化LAMP现场检测方法,并评价该方法的特异性和敏感性。结果显示,本实验所建立LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h。利用该方法检测大肠杆菌、肠炎沙门菌、金黄色葡萄球菌等山羊和绵羊常见的15种细菌的DNA样品,结果显示仅伪结核棒状杆菌检测为阳性,其他细菌检测为阴性。该方法对阳性质粒标准品pMD19-Cory的最低检出浓度为4.7 copies/μL。应用建立的LAMP方法和普通PCR方法对128份山羊皮下脓肿样品进行检测,结果显示LAMP方法和普通PCR方法的阳性率分别为21.1%(27/128)和20.3%(26/128),2种检测方法的总符合率为99.2%(127/128)。结果表明,本研究建立的可视化LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、快速的优点,为山羊和绵羊伪结核棒状杆菌感染的可视化现场快速诊断提供可行方法。

鹿流行性出血病病毒可视化RT-LAMP现场检测方法的建立

为建立鹿流行性出血病病毒(EHDV)可视化RT-LAMP检测方法。本研究根据EHDV内衣壳蛋白(VP7)基因保守序列设计2对特异性引物,通过反应条件优化,建立了EHDV可视化RT-LAMP检测方法。本研究建立的RT-LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h;利用该方法检测口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒和4个血清型EHDV的RNA样品,结果显示该方法能检测4个血清型EHDV RNA,与其他病毒RNA无交叉反应,特异性较强;该方法最低可检测到4.7×10^-8ng/μL的RNA,敏感性是普通RT-PCR方法的1000倍。应用建立的RT-LAMP和普通RT-PCR方法分别对85份牛血液样品进行检测,结果显示,二者阳性和阴性符合率分别为100%和98.8%。本研究建立的EHDV可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、快速和高通量检测的优点,为牛EHDV感染提供了快速可视化现场检测方法。