玳玳黄酮提取物的质量标准研究

目的：建立玳玳黄酮提取物的质量标准。方法：采用薄层色谱法鉴别玳玳黄酮提取物中的柚皮苷和新橙皮苷；采用紫外分光光度法测定玳玳黄酮提取物中总黄酮含量；采用高效液相色谱法同时检测玳玳黄酮提取物中柚皮苷和新橙皮苷的含量。结果：薄层色谱斑点清晰，易于识别，专属性强；紫外分光光度法新橙皮苷在4．44～26．64μg·mL-1范围内呈良好线性关系，平均加样回收率为99．92％（RSD=1．65％）；HPLC法柚皮苷在1.988—13．916μg·mL-1范围内呈良好线性关系，平均加样回收率为99．73％（RSD=1．56％），新橙皮苷在1．992～13．944μg·mL-1范围内呈良好线性关系，平均加样回收率为99．58％（RsD=1．89％）。结论：所建方法操作简便，结果准确，可有效控制玳玳黄酮提取物的质量。

玳玳黄酮提取物特征活性成分不同生理状态的药动学特性比较

为探索玳玳黄酮提取物临床降血脂药效特性,该文研究比较了玳玳黄酮提取物特征活性成分在正常大鼠及高脂血症模型大鼠体内药动学特性。实验采用UPLC-MS建立血浆中玳玳黄酮提取物特征活性成分柚皮苷和新橙皮苷定量测定法,通过建立高脂血症大鼠模型,比较正常大鼠和高脂血症模型大鼠灌胃玳玳黄酮提取物后血浆中柚皮苷和新橙皮苷的药动学差异。实验结果表明,玳玳黄酮提取物中特征活性成分柚皮苷和新橙皮苷在不同生理状态下的药动学特性存在显著性差异,高脂血症模型大鼠口服玳玳黄酮提取物后柚皮苷和新橙皮苷最大血药浓度C max与正常大鼠相比均明显增大,半衰期t1/2和体内滞留时间MRT缩短,但AUC0-24 h变小,达峰时间t max无差异;进一步证实玳玳黄酮提取物在高脂血症病理状态下能更好的发挥降血脂活性,其中特征活性成分柚皮苷和新橙皮苷是玳玳黄酮提取物发挥生物活性的物质基础。

玳玳果总黄酮提取物纯化工艺的再优化

目的：再优化玳玳果总黄酮提取物纯化工艺条件。方法：比较AB-8大孔吸附树脂柱以不同径高比纯化后的总黄酮纯度,优选大孔树脂柱装填径高比;考察收集的洗脱液体积对主成分群、总黄酮含量、特征成分新橙皮苷和柚皮苷相对含量的影响,优选收集的洗脱液区段。结果：玳玳果总黄酮提取物纯化工艺改进的条件为,大孔吸附树脂柱装填径高比为1：10,收集洗脱液区段为0.6-1.0 BV。采用再优化后的纯化工艺条件经3批验证实验,总黄酮纯度提高到90%,提取物中新橙皮苷和柚皮苷含量达60%以上,并保留主成分群相对含量的原有特征。结论：改进后工艺适合于总黄酮含量大于90%的玳玳果总黄酮提取物的制备。

玳玳黄酮降脂提取物的鉴别及其特殊杂质检测

目的:建立玳玳黄酮降脂提取物的鉴别及其特殊杂质辛弗林的检测方法。方法:采用薄层色谱法(TLC)鉴别玳玳黄酮降脂提取物,检测玳玳黄酮降脂提取物中可能存在的特殊杂质辛弗林。结果:以氯仿:甲醇:水(13∶6∶2)下层溶液为展开剂,玳玳黄酮降脂提取物中主成分得到快速、有效地分离鉴别;以正丁醇:乙酸乙酯:氨水:水(9∶3∶1∶2)为展开剂,检测辛弗林方法灵敏度高,斑点显色清晰,易于观察,最低检测限是0.08μg,玳玳黄酮降脂提取物中辛弗林的含量均小于10×10-6。结论:本实验所建立的方法能有效用于玳玳黄酮降脂提取物的鉴别与特殊杂质辛弗林的检查。

HPLC一测多评法同步测定玳玳果黄酮降脂提取物4个效应组分含量

目的建立HPLC一测多评法(QAMS)同步测定玳玳果黄酮降脂提取物4个效应组分柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷含量。方法采用高效液相色谱法,选择主成分柚皮苷为内参物,建立HPLC一测多评法,并与HPLC外标法同时测定的4个组分含量结果比较。色谱柱Lichrocart C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈(A)-0.2%冰醋酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱;流速1.0 m L/min,检测波长284 nm;柱温30℃;进样量10μL。结果玳玳果黄酮降脂提取物柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷的质量浓度分别在31.377~159.188μg/mL(r=0.999 5)、63.632~208.123μg/m L(r=0.999 8)、3.899~12.241μg/m L(r=0.999 6)、2.696~17.366μg/mL(r=0.999 4)范围内呈良好的线性关系;平均回收率(n=6)分别为97.99%、101.50%、98.21%、95.56%,RSD分别为2.07%、2.80%、2.92%、2.32%。结论以柚皮苷为内参物,HPLC一测多评法同步测定玳玳果黄酮降脂提取物4个效应组分含量结果准确,可用于玳玳果黄酮降脂提取物多指标质量监控。

玳玳果黄酮提取物效应组分新橙皮苷及柚皮苷敲出分离制备

目的对玳玳果黄酮提取物主要效应组分新橙皮苷及柚皮苷进行敲出分离纯化。方法采用制备薄层色谱法结合高压制备液相色谱分离技术,以氯仿-甲醇-水(13∶6∶2)下层溶液为展开体系,碘蒸气为定位显色剂,初步敲出分离新橙皮苷及柚皮苷;再用色谱性高压制备柱Ultiamte XB-C18(10 mm×250 mm,5μm),保护柱XB-C18(5μm),流速3.0 mL/min,检测波长284 nm,温度为室温,进样量100μL,进一步分离纯化新橙皮苷与柚皮苷,高效液相色谱法检测其纯度。结果制备薄层色谱法敲出分离得柚皮苷及新橙皮苷纯度为69.24%和75.45%,得率分别为23.15%和26.77%;高压制备液相色谱法进一步分离得柚皮苷及新橙皮苷纯度为98.81%和98.84%,得率分别为21.73%和24.87%。结论采用制备薄层色谱结合高压制备液相色谱可从玳玳果黄酮提取物敲出分离纯度大于98%的主要效应组分新橙皮苷及柚皮苷。

玳玳总黄酮提取物UPLC-MS体内外特征图谱

目的:建立玳玳总黄酮提取物主成分体内外正常与病理模型大鼠UPLC-MS特征图谱分析法,为玳玳总黄酮提取物入血成分及药效物质基础的阐明奠定基础。方法:采用UPLC-MS法,建立并比较玳玳总黄酮提取物体外特征图谱、正常和高脂血症模型大鼠灌胃玳玳总黄酮提取物后体内特征图谱。结果:经优选最佳色谱与质谱条件,并确立最佳采血时间及样品前处理方法后,质控9个色谱峰,相对保留时间RSD<0.5%,相对峰面积RSD<2.9%,提取回收率>75%,建立了玳玳总黄酮提取物体内外特征图谱模式。结论:所建立的特征图谱稳定、准确,可用于玳玳总黄酮提取物体外和正常及病理状态下的体内外成分分析评价,为"活性特征图谱"评价提供有益的探索。

玳玳果黄酮降脂提取物在体肠吸收过程和转运机制研究

目的探究玳玳果黄酮降脂提取物肠吸收部位、过程及转运机制。方法采用大鼠在体单向肠灌流模型,以提取物效应组分新橙皮苷及柚皮苷为指标,芦丁为内标,运用UPLC-MS/MS技术,建立玳玳果黄酮降脂提取物肠灌流液定量分析法;考察提取物在各肠段的吸收过程及特性;加入外排转运蛋白P-gp抑制剂维拉帕米(verapamil,VP),评价P-gp对提取物吸收的影响及肠道吸收参数(表观吸收系数Papp、吸收速率常数Ka和药物累计吸收百分比P%值)的变化;并以不同质量浓度提取物探究效应组分的吸收转运过程。结果玳玳果黄酮降脂提取物在不同肠段吸收量顺序为十二指肠>结肠>空肠≈回肠;与十二指肠比较,其他肠段的新橙皮苷及柚皮苷的肠道吸收参数Papp、Ka及P%均有显著性差异(P<0.05),十二指肠的新橙皮苷和柚皮苷的P%约是其余肠段的5~7倍;加入VP后,效应组分新橙皮苷及柚皮苷的Papp、Ka、P%均有显著提高,且在十二指肠的吸收量明显增加,P%约是VP空白组的4倍;提取物高、中、低浓度组柚皮苷的Papp、Ka无显著变化;中、低浓度组的新橙皮苷Papp、Ka随浓度增加略有上升;中浓度组的新橙皮苷Papp、Ka比高浓度组增大,Papp差异有统计学意义(P<0.05)。结论玳玳果黄酮降脂提取物的主要吸收部位是十二指肠;其效应组分在肠道的吸收受P-gp影响显著,各组分吸收参数变化趋势相同,不存在竞争性或非竞争性抑制作用;低浓度下表观吸收均属一级动力学过程;柚皮苷的吸收机制可能为被动转运,新橙皮苷的吸收机制可能为载体介导的促进扩散。

玳玳果黄酮降脂提取物体内效应组分排泄动力学研究

目的建立同时测定大鼠尿液及粪便中提取物效应组分新橙皮苷和柚皮苷含量方法,研究大鼠口服玳玳果黄酮降脂提取物后的尿药排泄动力学及排泄特征。方法采用UPLC-MS/MS建立效应组分新橙皮苷及柚皮苷在大鼠尿液及粪便的定量分析方法,计算口服玳玳果黄酮降脂提取物后不同时间点新橙皮苷及柚皮苷在尿液及粪便中的排泄率,并以亏量法计算尿液中的消除半衰期及消除速率常数,评价大鼠口服玳玳果黄酮降脂提取物后尿药排泄动力学及排泄特征。结果所建立的UPLC-MS/MS定量分析方法专属性良好、标准曲线及线性范围良好,方法准确度与精密度、定量下限均符合有关规定,该方法能够满足大鼠尿液及粪便中效应组分的定量检测需要;口服72 h后,大鼠尿液中新橙皮苷、柚皮苷的平均累计排泄率分别为(1.76±0.76)‰和(1.39±0.57)‰;大鼠粪便中新橙皮苷、柚皮苷的平均累计排泄率分别为(52.45±6.30)%和(51.57±4.80)%;口服后效应组分新橙皮苷及柚皮苷在尿液及粪便中的排泄量分别在24~36 h和4~8 h达到峰值;72 h后仍有药物经尿液排泄,给药后24 h粪便累计排泄率便达坪值;亏量法计算得新橙皮苷消除速率常数为(0.080±0.021)·h-1,消除半衰期为(9.41±3.22)h,柚皮苷消除速率常数为(0.077±0.017)·h-1,消除半衰期为(9.51±2.97)h,新橙皮苷及柚皮苷的动力学参数间差异无统计学意义。结论口服给药后效应组分原形即通过粪便较快地排出体外,粪便排泄是效应组分排出体外的主要途径,新橙皮苷及柚皮苷经尿液排泄的特征无明显差异。

玳玳果黄酮降脂提取物效应组分大鼠肝肠微粒体代谢特性研究

该文比较玳玳果黄酮降脂提取物效应组分新橙皮苷、柚皮苷在大鼠肝脏及肠道微粒体中的代谢差异,探讨效应组分在肝脏及肠道的Ⅰ相代谢特性。采用UPLC-MS/MS技术建立效应组分在肝肠微粒体Ⅰ相代谢孵育体系中的定量分析方法,并以差速离心法制备大鼠肝、肠微粒体,构建Ⅰ相代谢孵育体系,通过将各时间点药物剩余百分率的自然对数ln(X)对时间t作图计算代谢消除半衰期,比较效应组分的代谢特征。结果表明,所建立的UPLC-MS/MS定量分析方法专属性、标准曲线及线性范围良好,方法准确度与精密度、定量下限均符合规定,该方法能够满足大鼠肝肠微粒体Ⅰ相代谢孵育体系下效应组分的定量检测需要;大鼠肝微粒体Ⅰ相孵育体系中新橙皮苷代谢消除半衰期为(2. 20±0. 28) h,大于柚皮苷的底物消除半衰期(1. 97±0. 28) h,但差异无统计学意义;大鼠肠微粒体Ⅰ相孵育体系中新橙皮苷的代谢消除半衰期为(3. 68±0. 54) h,大于柚皮苷的底物消除半衰期(2. 26±0. 13) h,且差异有统计学意义(P<0. 05);提取物效应组分在肝微粒体中的消除半衰期均小于肠微粒体。该研究发现,玳玳果黄酮降脂提取物效应组分在大鼠肝、肠微粒体Ⅰ相代谢孵育体系中具有不同的消除半衰期,提示二者在大鼠肝脏及肠道中具有不同的代谢特征,肝脏可能为玳玳果黄酮降脂提取物效应组分的主要代谢部位,且提取物效应组分柚皮苷的Ⅰ相代谢强度大于新橙皮苷的代谢强度,推测导致该代谢特征差异的原因可能与黄酮苷B环羟基结合位点及甲氧基数量有关。为进一步指导玳玳果黄酮降脂提取物制剂的深度开发及临床开发应用等提供重要的实验依据。

玳玳果黄酮降脂提取物体内组织分布规律及特征研究

目的:建立UPLC-MS/MS分析方法同时测定玳玳果黄酮降脂提取物效应组分新橙皮苷和柚皮苷在大鼠10种脏器组织中含量,分布规律及特征。方法:采用UPLC-MS/MS技术建立提取物效应组分新橙皮苷及柚皮苷在大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠、脂质、肌肉组织中的定量分析方法;大鼠给药后分别于0.33,0.67,1,4,8 h的5个时间点,分别摘取以上10种脏器组织,测定脏器组织及血液中效应组分的质量浓度,采用DAS(V 2.0)药动学软件对各样本的药物浓度-时间数据进行房室拟合,并计算不同组织效应组分的药-时曲线下面积(AUC)及平均滞留时间(MRT)。结果:所建立的UPLC-MS/MS定量分析方法具备良好的专属性、标准曲线及线性范围良好、方法准确度与精密度、定量下限均符合有关规定;玳玳果黄酮降脂提取物效应组分在血液中的分布符合一室模型,除肾脏及脑组织外,其余脏器中提取物效应组分的房室特征多为静脉注射的二室模型,柚皮苷在肾脏中的拟合结果为非静脉注射的二室模型,新橙皮苷在脑组织拟合结果为静脉注射的三室模型,给药后8 h各组织中效应组分新橙皮苷及柚皮苷AUC值大小顺序均为小肠>胃>肾>脂质≈脾脏>肺>肌肉>肝>心>脑,效应组分在各脏器中均无明显蓄积;效应组分在血液、肾脏、肝脏中的滞留时间较长,MRT均大于2 h,脂质最短,MRT不足1 h;各脏器中新橙皮苷的药-时曲线下面积约是柚皮苷的3倍,而心、肝、肾中则是3.5,2.1和3.4倍。结论:玳玳果黄酮降脂提取物效应组分在大鼠组织中分布迅速,达峰时间早于血液;效应组分在肠道内消除缓慢,给药8 h后在各脏器中的含量均显著下降且无特异的蓄积部位。研究结果揭示玳玳果黄酮降脂提取物效应组分在大鼠体内的分布特征及规律,为进一步理解玳玳果黄酮降脂提取物在体内的作用靶点及机制奠定了基础。

玳玳果黄酮提取物关键效应组分辨识及调控脂质代谢作用机制研究

目的 探究玳玳果黄酮提取物及其敲出目标组分对脂肪变性细胞调控脂质代谢作用及机制,辨识关键效应组分。方法 采用油酸诱导建立HepG2脂肪变性细胞模型,非诺贝特为阳性对照,油红O染色法及甘油三酯(triglycerides,TG)和总胆固醇(totalcholesterol,TC)为评价指标,考察玳玳果黄酮提取物、柚皮苷(目标组分)、新橙皮苷(目标组分)、其他相关组分(黄酮提取物敲除柚皮苷、新橙皮苷)、黄酮提取物敲除其他相关组分(柚皮苷-新橙皮苷6︰7)对脂肪变性模型细胞脂质集聚影响。基于AMPK/SREBP-1c及PPARα信号通路,采用qRT-PCR法、Western blotting检测大鼠肝脏相关基因、蛋白的表达。结果 预防性给药后,与模型组相比,玳玳果黄酮提取物、柚皮苷、新橙皮苷、提取物敲除其他相关组分的细胞脂质积聚、TG及TC含量均有明显的改善(P<0.01或P<0.05);玳玳果黄酮提取物及柚皮苷、新橙皮苷可使促腺苷酸激活蛋白激酶(ATP-activated protein kinase,AMPK)的mRNA及磷酸化蛋白表达水平明显升高(P<0.01或P<0.05);显著抑制并明显下调固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein,SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、乙酰辅酶羧化酶(coenzymecarboxylase,ACC)的mRNA和蛋白表达水平(P<0.01或P<0.05);可促进过氧化物酶增殖物激活受体(peroxidaseproliferator-activatedreceptor, PPARα)、肉毒碱棕榈酰基转移酶(carnitine palmitoyltransferase-1,CPT-l)的mRNA及蛋白表达水平明显上升(P<0.01或P<0.05);其他相关组分无明显差异。结论 玳玳果黄酮提取物及其关键效应组分柚皮苷、新橙皮苷可有效改善脂质积聚;其作用机制为激活AMPK促其蛋白磷酸化表达,从而抑制脂质合成,同时促进脂肪酸的氧化分解,由此减少脂肪沉积,发挥调控脂质代谢的作用。