微流控法制备载卵母细胞水凝胶微球及其玻璃化保存

目的通过微流控法制备载卵母细胞海藻酸钠微球,在低浓度保护剂下实现卵母细胞玻璃化保存。方法采用流动聚焦型微流控芯片,通过调整芯片结构、海藻酸钠溶液浓度和流速比,制备大小均匀、空包率低、低温耐受的载卵母细胞海藻酸钠水凝胶微球。在低浓度低温保护剂下将微球玻璃化保存,复温后检测存活率,采用细胞松弛素B和氯化锶孤雌激活卵母细胞,与Cryotop玻璃化法对比卵母细胞存活率和卵裂率、囊胚率。结果制备的海藻酸钠微球在冷冻复温前后的体积稳定且结构完整,在将卵母细胞包封在海藻酸钠水凝胶中后,空包率低,存活率、卵裂率和囊胚率与新鲜组相比无显著差异。在低浓度低温保护剂10%DMSO+10%乙二醇(EG)+0.5 mol/L海藻糖中玻璃化冻存后卵母细胞的存活率达到92.48%,卵裂率70.80%,囊胚率20.42%,与高浓度保护剂15%DMSO+15%EG+0.5 mol/L海藻糖中Cryotop玻璃化法相比无显著性差异。结论本文设计制作了三通道内部交联芯片并用于卵母细胞玻璃化保存的微流控系统,可生成大小均匀、空包率低、低温耐受的载卵母细胞海藻酸钠水凝胶微球,在低浓度保护剂下实现玻璃化保存,为卵母细胞玻璃化保存方法提供新思路。

玻璃化保存草莓多酚氧化酶和过氧化物酶活性变化的实验研究

低温部分玻璃化保存是食品的最佳保存方法之一。本文通过对草莓在冻结过程、玻璃化（－７５℃）和非玻璃化（－２５℃）保藏两个月中生特征的实验研究，发现冻结及贮藏过程均会引起草莓中可溶性多酚氧化酶（ＰＰＯ）过氧化物酶（ＰＯＤ）的酶活性较大幅度变化，并对其机理和食品保存质量的影响进行了分析，认为选择适宜的冻结和贮藏条件是确保低温部分玻璃化保存食品质量的两个不可分割的环节。

草莓冻结玻璃化保存的实验研究

以草莓为样品进行了食品冻结玻璃化保存的实验研究。结果表明，贮藏于玻璃态 （－７５℃ ）的草莓质量明显优于贮藏在一般商用温度（－２９℃，－１８℃ ）下的草莓质量。

成纤维细胞玻璃化保存的初步实验研究

成纤维细胞是构建组织工程化真皮的种子细胞 ,实现成纤维细胞的低温保存对成功保存组织工程化真皮有着重要的意义。采用不同组成及浓度的玻璃化溶液对成纤维细胞进行玻璃化低温保存实验 ,并考虑了离心次数对细胞存活率的影响。实验结果表明 :玻璃化溶液的组成、浓度及复温后的离心次数等因素对细胞的存活率均有明显的影响。在实验条件下 ,采用组分配比为 5 4mol/LEG+1 4mol/LDMSO的玻璃化溶液对成纤维细胞进行玻璃化保存 ,复温后以 10 0 0r/min的转速离心 1次(5min)后 ,再以 80 0r/min的转速离心 4次 (每次 4min) ,可获得较高的细胞存活率 ,其值为87 1%。

二甲基亚砜和乙二醇对玻璃化保存大鼠坐骨神经的协同保护作用

目的探讨冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)单独及联合应用对周围神经玻璃化保存的影响。方法取30只3月龄雄性SD大鼠双侧坐骨神经,制成长约15 mm神经段,在含不同冷冻保护剂的玻璃化溶液中-80℃保存4周:空白组(不含冷冻保护剂)、10%DMSO组、20%EG组、10%DMSO+20%EG组(每组n=15)。透射电镜观察神经组织超微结构,Calcein-AM和PI双染色激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测神经组织生物活性,Western blotting检测神经组织Caspase-3、Caspase-8表达。取玻璃化保存4周后的各组坐骨神经,于37℃、5%CO2DMEM(含l0%胎牛血清)中培养7 d,RT-PCR、Western blotting检测培养神经表达的神经生长因子(NGF)和胶质源性神经营养因子(GDNF)。结果坐骨神经玻璃化保存4周,透射电镜显示:空白组神经纤维脱髓鞘变和轴质萎缩严重,而10%DMSO组、20%EG组、10%DMSO+20%EG组神经纤维脱髓鞘变和轴质萎缩均较轻(以10%DMSO+20%EG组最轻)。LSCM检测显示:空白组神经纤维绿色荧光较弱,而红色荧光较强、分布较广;10%DMSO组、20%EG组神经纤维绿色荧光较强、红色荧光较弱;而10%DMSO+20%EG组神经纤维绿色荧光最强、红色荧光最弱。Western blotting检测显示:玻璃化保存后坐骨神经Caspase-3、Caspase-8的表达,空白组与10%DMSO组、20%EG组、10%DMSO+20%EG组比较,10%DMSO+20%EG组与10%DMSO组、20%EG组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05);但10%DMSO组与20%EG组间差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR、Western blotting检测显示:培养神经NGF、GDNF的表达,空白组与10%DMSO组、20%EG组、10%DMSO+20%EG组比较,10%DMSO+20%EG组与10%DMSO组、20%EG组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05);但10%DMSO组与20%EG组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 10%DMSO、20%EG对-80℃玻璃化保存的坐骨神经具有保护作用,能提高玻璃化保存后神经组织的生物活性,且二者联合应用具有协同作用。

低温玻璃化保存理论在水产品贮藏中的应用

一、引言 低温保存是食品的最佳保存方法之一,但食品原料在冷加工、贮藏和运输过程中质量的下降仍无法避免。早在本世纪40年代起,食品科学家和工程师们就如何提高冻结食品的质量进行了不懈的努力,做过大量的研究,其中最有代表性的成果是T.T.T.概念的提出。80年代初,随着食品聚合物理论的提出,食品的低温保存研究进入了一个新纪元,到90年代就有1000多篇相关论文发表,而国内这方面的研究刚刚起步。

不同浓度川芎嗪的玻璃化保存液对施万细胞凋亡的作用

目的探讨不同浓度川芎嗪(TMP)的玻璃化保存液对大鼠施万细胞凋亡及调控基因表达的影响,以便获得川芎嗪的最佳浓度。方法 20只SD大鼠,切取双侧坐骨神经(共40条),将其随机分成A、B、C、D、E组,每组8条,分别用含不同浓度川芎嗪的玻璃化保存液在-20℃保存3周(A组:0mg/L、B组:80mg/L、C组:160mg/L、D组:320mg/L、E组:640mg/L)。3周后取神经进行苏木素-伊红(HE)染色光镜检查;免疫组化法检测Bcl-2、Bax;末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。结果 D组神经施万细胞凋亡数量明显少于其余各组施万细胞凋亡数量,A组神经施万细胞凋亡数量明显多于其余各组施万细胞凋亡数量;D组Bcl-2的阳性表达率最高,且明显高于其余各组,A组Bcl-2的阳性表达率最低,且明显低于其余各组;D组Bax阳性表达率明显低于其余各组,A组Bax阳性表达率明显高于其余各组。结论川芎嗪能通过调节Bcl-2和Bax的表达而有效抑制施万细胞的凋亡,在-20℃含川芎嗪的玻璃化液保存大鼠坐骨神经,川芎嗪的浓度以320mg/L最佳。

玻璃化保存工程化组织产品的实验与技术

目的:总结近年来玻璃化保存技术的新进展和多种工程化组织玻璃化保存的实验研究。探讨影响工程化组织低温保存的主要因素、评价指标等,以期指导玻璃化保存工程化组织的实验研究。资料来源:应用计算机检索Medline,EBSCO,ScienceDirect Onsite以及google scholar引擎中1980-02/2006-05关于细胞和组织低温保存的文献,检索词“tissue engineering,engineered tissue,cryopreservation,vitrification,ice-free cryopreservation,vitreous cryopreservation”,检索词被分别组合进行检索,限定文献语言种类为English。同时计算机检索万方数据库1980-02/2006-05关于细胞和组织低温保存的文献,检索词“组织工程,工程化组织,冻存,玻璃化保存”,限定文献语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,选出与研究关系密切的文献。纳入标准:研究对象为动物或人,包括基础与临床研究内容。重点选取与玻璃化保存技术基本原理相关以及具体的工程化构建物玻璃化保存相关的文献。排除标准:关于配子,胚胎和植物,食品等的玻璃化保存文章。资料提炼:共检索到122篇关于细胞和组织低温保存的文献,其中与本实验关系密切的文献17篇,间接相关的文献42篇,最终纳入31篇符合标准的文献。资料综合:组织工程产业化要求长期而稳定的保存包含活细胞的工程化组织产品,以及产品中细胞与材料的黏附。相对于传统的低温冻存技术而言,玻璃化保存因在保存过程中无细胞内外冰晶形成,可以改善复温后的细胞活力,并能保护细胞和支架材料之间的黏附。本文从近年来玻璃化保存技术的新进展和多种工程化组织玻璃化保存的实验研究进行综述,分析了玻璃化保存液要求高浓度,对细胞有非特异毒性损伤,对悬浮单细胞的玻璃化保存能得到较高的细胞存活,而与支架材料结合的种子细胞存活除受到冻存试剂和流程的影响外还受到自身结构的影响。结论:玻璃化保存是较好的生物系统保存方法,可以为工程化组织产品提供可靠的保存,但急需发现新的低毒高效的玻璃化试剂以及优化保存流程。

玻璃化保存对家兔颈总动脉松弛行为的影响

实验测定了玻璃化保存前后家兔颈总动脉的松弛曲线G(t),利用数学方法将连续松弛谱函数简化,并结合经验公式对实验数据进行非线性拟合,得到了动脉的3个材料参数(C,1τ和2τ).通过比较玻璃化保存前后动脉松弛行为特征参数的差异,得到了玻璃化保存对动脉力学行为的影响.结果表明:①经过约600 s的松弛过程后,新鲜动脉约可保持初始应力的70%,而玻璃化保存动脉则仅可保持初始应力的约60%;②玻璃化保存动脉的短期松弛时间常数1τ相对新鲜对照组而言显著较小,约降低60%,长期松弛时间常数2τ约降低15%,而C几乎不变.

牛体外受精胚的玻璃化保存及细胞遗传学研究

用 2 5 %的乙二醇和 0 .2mol/L蔗糖与 2 5 %乙二醇混合的玻璃化溶液对牛体外受精的早期囊胚用 1步法冷冻保存 ,融解后 ,在D -PBS液 (含有 0 .5mol蔗糖 )中 15min除去冷冻保护剂 ,培养 48和 96h。结果表明 :用含有 0 .2mol的蔗糖和 2 5 %的乙二醇混合的玻璃化溶液保存的早期囊胚的生存力明显高于不含蔗糖的玻璃化溶液 (P <0 .0 0 1)。染色体分析结果表明 :含有蔗糖的玻璃化溶液保存的囊胚的卵裂细胞数明显高于单独使用 2 5 %乙醇保存的囊胚 (P <0 .0 5 )。染色体异常发生率无明显变化。

浅析猪胚胎玻璃化保存

随着生物技术发展,猪胚胎保存的重要性越来越大。但由于猪胚胎对低温特别敏感,因而其研究进展受到了极大限制。如何提高猪胚胎保存效率成为急待解决的重大问题。作者通过对国内外胚胎玻璃化保存研究进展进行分析,就胚胎的高脂含量以及保存时胚胎细胞骨架受损做出分析提出见解。

震荡热管应用于玻璃化保存中的数值模拟

介绍了震荡热管应用于玻璃化保存的新方案,建立了生物组织在玻璃化保存过程中的数学模型,通过ANSYS分析软件,对样品在降温过程中的温度场进行了计算分析和数值模拟。得出了生物组织的瞬时温度分布,并通过模拟结果,计算出了生物组织在降温过程中的降温速率可达2×104℃/s。研究结果表明:极快速的降温速率可使细胞或组织快速通过0℃—-60℃的危险温度区域,从而抑制冰晶的生成和长大,减轻胞内冰造成的细胞损伤。

用于卵母细胞玻璃化保存的微流控系统

卵母细胞玻璃化保存的需求日益增加,目前人工或自动化保存装置分步加载和去除低温保护剂易造成卵母细胞的渗透损伤和丢失。本研究采用低成本易制作的PMMA微流控芯片,结合石英毛细管搭建微流控混合系统,既实现了保护剂的连续加载/去除,又为后续浸入液氮实现自动玻璃化保存做准备。通过采用手动多步法和微流控法对小鼠MⅡ期卵母细胞加载/去除低温保护剂,对比卵母细胞的体积响应、存活率和后续发育率。结果表明:微流控法注射时间8 min组的卵母细胞存活率、卵裂率和囊胚率,分别达到93.25%、77.12%、53.00%,显著高于手动多步法,与对照组无显著性差异(P<0.05)。使用PMMA芯片结合石英毛细管的微流控系统,显著减小了卵母细胞的渗透损伤和细胞丢失率,简化了操作步骤,为基于微流控技术的卵母细胞与胚胎的自动玻璃化保存装置的开发提供关键技术支撑。

磁热复温对玻璃化保存脐动脉力学特性的影响

目的探究磁热复温对玻璃化保存的脐动脉组织形态以及生物力学特性的影响。方法采用磁热方式对玻璃化保存的脐动脉进行复温,与传统水浴复温方式进行对比,分析溶液体系内的温度分布及热应力,并通过对脐动脉进行组织染色及力学测试评价复温效果。结果与水浴复温相比,通过磁热复温产生的温度梯度和热应力较小,可以有效减小复温阶段热应力损伤,实现快速均匀的复温;磁热复温可以有效避免脐动脉出现断裂和微裂纹现象,并且复温后脐动脉细胞外基质、胶原纤维、弹性纤维以及肌纤维等结构分布均匀,可以较好地保存脐动脉的宏观和微观结构;采用水浴和磁热复温后的脐动脉均出现不同程度的硬化,其中后者弹性模量和极限应力与新鲜脐动脉无显著差异,具有相似的单向拉伸特性,表现出良好的弹性与韧性。结论相比水浴复温,磁热复温方式可以有效减小复温阶段的损伤,保证脐动脉具有较好的宏观、微观结构和生物力学特性。研究结果为脐动脉等较大组织或器官的玻璃化保存提供重要依据。

玻璃化保存降温过程中微通道的热应力数值模拟

微通道方法可用于增强玻璃化保存的传热,但在超高速冷却速率下,通道结构可能受到不均匀温度分布产生的热应力影响,导致结构断裂。为研究热应力的变化规律,本研究以ANSYS Workbench为仿真计算平台建立了三维计算流体动力学(computational fluid dynamics,CFD)模型,以模拟微通道中的两相流及其相关热传递过程。对降温过程中的流固耦合传热过程进行整场求解,从而同时得到降温过程的瞬态温度场和瞬态应力场。通过仿真计算在不同冷却条件下通道结构中热应力的最大值,用于评估微通道结构的可靠性。结果表明,本研究提出的CFD方法为预测和优化微通道冷却系统提供了有效的工具。

震荡热管技术在生物材料低温玻璃化保存中的应用

玻璃化保存是一种新的低温保存方法,可通过提高保护剂浓度或增大降温速率两个途径实现溶液的玻璃化,但高浓度的低温保护剂会对细胞产生毒性损伤和渗透压损伤,因此一般需要快速的降温速率来实现玻璃化。震荡热管具有强化传热的性能,文章综述了国内外震荡热管的理论研究现状与实际应用,讨论了其提高降温速率的技术路线,即震荡热管具有优良的传热性能,可提供细胞在冷冻过程中所需的极快速的降温速率;同时对应用于玻璃化保存的可行性进行分析,认为震荡热管可加快细胞在降温过程中通过危险温度区域的时间,从而减少其冷冻损伤。

玻璃化保存对家兔跟腱松弛行为的影响

玻璃化保存方法操作方便、保存效果良好,近年来已被广泛用于血管、肌腱等生物软组织的深低温保存.基于QLV理论,采用新的参数拟合方法得到QLV模型特征参数,通过比较玻璃化保存前后QLV模型中特征参数的差异,研究玻璃化保存对跟腱松弛行为的影响,以期建立和完善玻璃化保存跟腱的粘弹性力学评价指标.本研究对玻璃化保存前后的肌腱做应变水平为2%的松弛实验,并成功地应用QLV模型分别描述了跟腱标准松弛实验的线性加载段和应力松弛段应力随时间的变化.结果表明:①经过1 200s的松弛,玻璃化保存前后跟腱的最终应力松弛水平相差不大(约4%);②针对QLV模型,充分考虑标准松弛实验中线性加载段的影响,建立了一种松弛全过程数据拟合方法,用模型很好地描述了整个松弛过程应力随时间的变化;③通过对比玻璃化保存前后QLV模型中各特征参数的变化,发现跟腱经过玻璃化保存后其刚性变强、弹性响应能力增加,而其粘性响应有差异;④用Wilcoxon符号秩检验法对玻璃化保存前后跟腱的松弛行特征参数进行统计学分析,结果表明保存前后其特征参数没有显著性差异(p>0.05),说明所设计的玻璃化保存方案能够很好地保留跟腱的粘弹性力学性能.

大鼠肝细胞的玻璃化保存

玻璃化方法保存生物材料是近年来低温生物医学领域较为热门的话题,应用这种方法可以使生物材料在保存过程中免于冰晶效应和溶液效应的损伤,提高存活率。目前认为用玻璃化方法保存生物材料是最理想的深低温保存方法。本实验选用大鼠肝细胞作为样品,进行玻璃化保存的尝试,旨在验证玻璃化保存肝细胞的可行性,并提供一种肝细胞的保存方法。

硅质微通道玻璃化保存芯片的结构热应力分析

玻璃化保存是指以超高速降温促使生物材料发生玻璃化转变后低温存贮,能有效避免传统低温保存过程中冰晶生长等因素造成的低温损伤,是细胞、组织等生物材料的理想长期保存方法。基于微通道换热原理的玻璃化保存芯片技术能够满足玻璃化保存的超高速降温需求,但降温过程中的快速温度变化将产生较大的热应力,对芯片结构可靠性产生重要影响。特别当芯片采用硅这种生物相容性好但强度较差的材料时,热应力影响更为突出。建立微通道玻璃化保存芯片的三维CFD模型,对降温过程中的流动沸腾换热过程和热应力作用进行整场求解,预测不同条件下芯片降温性能及结构中的应力场,并采用正交试验方法设计算例,分析微通道深度、宽度、壁厚和长度等结构参数对芯片内热应力的影响规律。结果表明,各参数对硅质微通道芯片结构热应力的影响程度从大到小依次为:通道深度,通道壁厚,通道宽度,通道长度;通过正交试验所得出的最优参数组合能在满足玻璃化保存所需降温速率的同时保证芯片的结构强度。所提出的仿真方法和结果将为微通道玻璃化保存芯片技术的进一步发展和应用提供重要支持。

4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化保存效果

目的 评估二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、甘油、丙二醇、乙二醇玻璃化法保存人指固有神经中的保护效果,筛选合适的人指固有神经冷冻保护剂。方法 取截肢手术后患者放弃肢体的指固有神经,分为实验组(30%DMSO组、甘油组、乙二醇组、丙二醇组)和空白对照组进行玻璃化法于液氮(-196℃)中保存3周。复温后进行光学显微镜观察、共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测、指固有神经片段的神经生长因子(nerve growth factor,NGF)检测。结果 光镜观察:空白对照组神经鞘膜结构模糊,神经纤维排列疏松、紊乱;实验组神经鞘膜较为完整,神经纤维排列相对整齐、紧凑。LSCM结果:采用钙黄绿素-AM (calcein-AM)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色后空白对照组神经纤维绿色荧光强度较弱,红色荧光强度较强。实验组绿色荧光较空白对照组均增强,红色荧光强度均减弱。ELISA检测结果:空白对照组12.95±3.03pg/ml、乙二醇112.64±3.54pg/ml、30%DMSO109.51±9.98pg/ml、甘油61.47±3.34pg/ml、丙二醇62.53±3.64pg/ml。结论4种冷冻保护剂对人指固有神经的玻璃化法保存均有保护作用,其中乙二醇效果最佳,更适合用于人指固有神经玻璃化保存。