红掌小滴玻璃化法超低温保存研究

以红掌腋芽为试材,探讨小滴玻璃化法对红掌超低温保存的影响因素,并对再生植株进行遗传稳定性检测。结果表明,红掌腋芽置于含0.4 mmol/L蔗糖和2 mmol/L甘油的MS固体培养基中预培养4 d后,在0℃下80%PVS_(2)处理50 min,转到铝箔条上PVS_(2)液滴中,将铝箔条迅速浸入液氮中,2 s后直接转入装满液氮的冻存管中,投入液氮至少保持30 min;室温下用含有1.2 mmol/L蔗糖的MS液体培养基复温并卸载20 min后置于恢复培养基上,腋芽存活率高达63.70%。通过ISSR和SSR分子标记检测,再生植株的遗传稳定性未发生改变。该研究结果为红掌种质资源的长期保存提供有效途径。

玻璃化法及小液滴玻璃化法对香石竹茎尖超低温保存效果的影响

[目的]探索更有效的香石竹茎尖超低温保存方法,为球宿根花卉的超低温保存提供相关技术支持。[方法]以香石竹茎尖为材料,研究预培养条件(蔗糖浓度、预培养时间)、玻璃化处理时间和玻璃化方法(常规玻璃化法、小液滴玻璃化法)对香石竹茎尖超低温保存效果的影响。[结果]在0.5 mol/L的蔗糖浓度培养基上预培养5 d香石竹茎尖成活率最高,为88.3%;玻璃化处理80 min成活率最高,可达86.7%;常规玻璃化法成活率及再生率在80%以上,小液滴玻璃化法成活率可达90%以上且全部再生,小液滴玻璃化法再生天数比常规玻璃化法少3~5 d。[结论]小液滴玻璃化法是一种有发展前景的超低温保存方法。

怀山药种质资源的玻璃化法超低温保存

本文对怀山药种质资源的玻璃化法超低温保存技术进行了研究。结果表明，怀山药带芽茎段玻璃化法超低温保存较佳的技术体系是继代生长60d的怀山药无菌苗置4℃冰箱低温锻炼7d；在无菌条件下切取1～1．5cm的带芽茎段，转至含5％蔗糖＋3％甘露糖的培养基内，置4℃冰箱预培养2d；用60％的PVS1（22％甘油＋13％乙二醇＋13％聚乙二醇＋10％二甲基亚砜）在室温下处理60min，再用100％的PVS1在0℃条件下处理60min，随即迅速投入液氮；保存24h后，在37℃水浴中快速化冻，用含5％蔗糖的MS培养液洗涤4次，每次停留10min；转至再生培养基（MS＋KT 2mg／L＋NAA 0．02mg／L）再培养，成活率可达77．14％，再生苗与常温苗形态指标差异不大。

香蕉茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生

以香蕉（Musa spp.）为试材,对其离体培养茎尖玻璃化法超低温保存影响因素进行研究.结果表明,不定芽在MS＋3.0～5.0 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA的培养基上分化较好.香蕉茎尖超低温保存较佳体系是：2.0～3.0 cm的茎尖在含0.4 mol/L蔗糖培养基上预培养2 d,剥取带1～2个叶原基的茎尖（长1.0～1.5 mm）,室温（25℃）下装载液（MS＋2 mol/L甘油＋0.4 mol/L蔗糖）装载20～30 min,然后用玻璃化溶液（PVS2）于0℃下处理40 min,换1次PVS2后迅速投入液氮.保存至少1 h后,在40℃水浴中化冻90 s,用1.2 mol/L蔗糖培养液洗涤2次,每次10 min,然后转入含0.3 mol/L蔗糖的MS培养基上,暗培养10～15 h后转移到含0.5 mg/L 6-BA的MS培养基中,暗培养1周后转移到正常光下,3个香蕉品种（巴西蕉、广东香蕉2号、广东粉蕉1号）的成活率分别为75.9%、40.0%和69.6%,再生率分别为63.4%、35.0%和63.4%.再生植株生长和分化正常,生根后可移栽成活.

食用百合种质的玻璃化法超低温保存技术初探

以离体茎尖为试材 ,采用玻璃化法 ,对食用百合离体超低温保存技术进行了初步研究。结果表明 ,用2～ 3mm茎尖 ,在MS +0 .5mol·L-1蔗糖浓度的培养基上预培养 1～ 2d ,室温下植物玻璃化溶液 (PVS2 )处理 2 0min ,换入新鲜的PVS2 ,迅速投入液氮中 ,2d后取出 ,在 4 0℃水浴中解冻 2min ,再在 2 5℃水浴中解冻 10min ,用1.2mol·L-1蔗糖液体培养基洗涤 2 0min ,接种在 6 -BA 0 .5mg·L-1+NAA 0 .1mg·L-1+GA3 0 .3mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+琼脂 7g·L-1的MS培养基上 ,2 5℃弱光培养 1周后转为正常光下培养 ,2周后再生率达到 5 2 .6 %。

大蒜茎尖玻璃化法超低温保存技术研究

用山东‘苍山大蒜’进行了茎尖玻璃化法超低温保存技术的研究。5～8mm大蒜茎尖在MS+0.7mol/L蔗糖的固体培养基上预培养7d,切取3.0～3.5mm的茎尖,在20℃下经60%PVS2处理60min,再于0℃下用PVS2处理5～60min后,换适量新鲜PVS2,浸入液氮。保存2d或1个月后取出,在37℃水浴中解冻2min,用MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤2次,每次10min,经过恢复培养,茎尖成活率最高可达到100%。

玻璃化法超低温保存猕猴桃离体茎尖及其植株再生

以中华猕猴桃矮型种质为离体培养材料，建立试管无性系，对其离体茎尖的玻璃化法超低温保存技术进行研究，探讨猕猴桃种质长期保存的适宜途径。结果表明，含1～2个叶原基（1．5～2．5mm）的茎尖，在5％二甲基亚砜（DMSO）＋5％蔗糖＋MS培养基上预培养4d后，于室温下用2mol／L甘油＋0．4mol／L蔗糖预处理30min，再在0℃下用玻璃化液（PVS2）脱水处理40min并迅速投入液氮中，保存24h后接种至继代培养基上再培养，成活率和再生率分别为56．7％和51．6％。再生植株生根后可移栽成活。

高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)茎尖包埋-玻璃化法超低温保存与植株再生

使用包埋-玻璃化法对两种来源的高山红景天茎尖进行超低温保存研究，探讨蔗糖预处理、包埋过程中渗透处理和不同温度下玻璃化液PVS2处理的时间对超低温保存后茎尖存活率的影响．结果表明，茎尖依次在0．3、0．5、0．7、1．0mol·L^-1的蔗糖溶液中各预培养1d后，转入1．0mol·L^-1的蔗糖溶液中继续培养4d，然后使用附加2mol·L^-1甘油和1mol·L^-1蔗糖的包埋液渗透处理60min，包埋珠在0℃处理180～210min后投入液氮，48h后用40℃水浴快速化冻3min，用含有1mol·L。蔗糖的改良MS培养液洗涤20min，转入MS＋6-BA1mg·L^-1＋NAAO．1mg·L^-1固体培养基中在22℃条件下进行暗培养，2d后转移入光照培养，最高成活率接近100％，再生植株生长和分化正常．

番木瓜茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生

研究了番木瓜 (CaricapapayaL .)茎尖玻璃化法超低温保存的一些影响因素。结果表明 :无菌试管苗在MS +BA 0 5mg/L +NAA 0 1mg/L +GA3 1 0mg/L的培养基上生长较好。番木瓜茎尖超低温保存较佳体系是 :3～ 5cm的茎尖在含有 5 %二甲基亚砜 (DMSO)培养基上预培养 3d ,解剖镜下剥取含 1～ 2个叶原基的茎尖 (1 5～ 2 5mm长 ) ,先在室温下于 6 0 %的玻璃化溶液 (PVS2 )中装载 4 0～ 5 0min ,再用PVS2于 0℃下处理 30min ,换 1次PVS2 溶液后迅速投入液氮。保存 2 4h后 ,在 4 0℃水浴中化冻 ,用 1 2mol/L的蔗糖培养液洗涤两次 ,转入继代培养基上再培养 ,成活率和再生率分别达 5 3 7%和 5 2 6 %。

铁皮石斛种质资源的玻璃化法超低温保存

对铁皮石斛的原生质体、原球茎进行了玻璃化法超低温保存研究 ,存活率分别达 4 8%和 88% .实验结果表明 :材料、预处理、化冻方法。

马铃薯茎尖玻璃化法超低温保存后DNA甲基化的遗传变异

对青薯9号、大西洋、小白花和E1074种基因型的马铃薯茎尖进行玻璃化法超低温保存，并运用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术分析4种材料超低温保存前后DNA甲基化的的变异情况。结果表明：经玻璃化法超低温保存，四个品种的成活率分别为86．93％,／o、78．03％、71．57％和65．82％。成活率和再生率因基因型而异，且不同基因型之间的差异显著。用MSAP技术分析超低温保存前后植株甲基化的结果显示：用16对引物组合对4个品种进行扩增，平均扩增出493条带；与对照相比，4个品种基因组的CCGG序列中有8．4％～14．3％DNA发生甲基化变化。经超低温保存后，去甲基化和甲基化都有发生，并以去甲基化变化为主要趋势。本文运用MSAP技术对马铃薯超低温保存前后植株进行胞嘧啶甲基化分析表明，使用MSAP检测超低温保存后再生植株DNA甲基化遗传变异非常有效。

胡萝卜悬浮培养细胞和原生质体的玻璃化法超低温保存

采用玻璃化法成功地超低温保存了胡萝卜悬浮培养细胞及其原生质体 ,存活率分别为 83.3%(TTC法检测 )和 4 7% (FDA法检测 ) .冻后细胞能恢复生长并再生植株 .

玻璃化法超低温保存柑桔茎尖及植株再生

采用玻璃化法对柑桔茎尖的离体超低温保存进行了研究。约 10mm长的柑桔茎尖于含 5 %二甲基亚砜 (DMSO)的培养基上预培养 3d ,切取 2～ 2 .5mm长的茎尖 ,室温下6 0 %玻璃化溶液 2 (PVS2 )装载 2 0～ 30min ,然后用PVS2 于 0℃处理 5 0～ 6 0min ,换入新鲜的PVS2 ,迅速投入液氮中 ,2 4h后在 4 0℃水浴中迅速化冻 ,再用 1.2mol/L蔗糖培养基洗涤 2次 ,接种于含BA 1.0mg/L的MT培养基上 ,2 6℃暗培养 1周后转于正常光下培养。枳壳茎尖超低温保存后用氯化三苯基四氮唑 (TTC)法检测 ,成活率为 10 0 % ,培养再生率达到 90 % ,再生后的苗能正常生根 ,与对照没有形态上的变异 。

菠萝茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生

以菠萝为试材,建立试管无性系,进行玻璃化法超低温保存及植株再生研究,结果表明,约2.0～3.0 cm的菠萝茎尖于含有0.5 mol/L蔗糖的培养基上预培养1～2 d,剥取含1～2片叶原基(1.0～2.5 mm长)的茎尖,室温(25℃)下用LS装载液预处理50min,再用PVS2溶液于0℃下处理40 min,换入新鲜的PVS2溶液后迅速投入液氮,保存24 h后在40℃水浴中迅速化冻90 s,用1.2 mol/L的蔗糖培养液洗涤2次,每次10 min,然后转入含0.3 mol/L蔗糖的MS培养基上,暗培养48 h后转入含BA 0.5 mg/L的MS培养基上,暗培养1周后转移到正常光下,4个菠萝品种(澳大利亚卡因、夏威夷、巴厘、台农16号)的成活率分别为96.5%、95.3%、78.6%、87.7%,再生率分别为93.2%、92.6%、76.7%、87.7%。再生植株生长和分化正常,其形态上与对照一致,生根后可移栽成活。

高山红景天愈伤组织的玻璃化法保存及植株再生

采用玻璃化法对高山红景天的愈伤组织进行了超低温保存研究.高山红景天愈伤组织在8%蔗糖中暗培养5 d后,先用25℃的60%玻璃化保护剂PVS2预处理20 min,转至100%PVS2于-20℃乙醇浴中处理2 h后,投入液氮进行保存,48 h后使用40℃水浴快速化冻.冻存后的愈伤组织用液体培养基MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+40%蔗糖洗涤3次,再转入MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.5 mg/L固体培养基中在22℃条件下进行暗培养,2周后转入光照培养(光照强度800 lx).6周后观察到高山红景天愈伤组织呈鲜绿色,长势较为旺盛,存活率可达到78.24%.冻存后的愈伤组织可诱导成苗.

江西山药茎尖包埋玻璃化法超低温保存及其遗传稳定性检测

采用植物组织培养法对广丰药薯茎尖的包埋玻璃化法超低温保存程序进行优化,并采用扩增片段长度多态性（AFLP）分子标记法和流式细胞术对其冻后再生苗的遗传稳定性进行检测,同时将超低温程序应用到江西山药其他地方品种,旨在为薯蓣属植物种质资源的长期保存奠定理论基础。结果表明,广丰药薯茎尖预培养的较佳时间为5 d,较佳的蔗糖浓度为0.75 mol·L^-1;装载的较佳时间为40 min;脱水的较佳温度为0℃,较佳时间为60 min;冻后黑暗培养7 d可以显著提高其成活率。用AFLP分子标记法和流式细胞术对茎尖冻后再生植株的遗传稳定性进行检测,没有发现异常条带和染色体倍性变化,气孔观察也未发现叶下表皮气孔参数的显著变异。将这种超低温保存程序用于江西山药其他基因型,成活率约为40%-85%。该研究建立的包埋玻璃化法超低温保存程序能保证江西山药的遗传稳定性,可为建立江西山药种质资源超低温保存库提供一定的技术支撑。

柿休眠芽茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生

对柿 (DiospyroskakiThunb .)休眠芽茎尖进行了玻璃化法超低温保存及植株再生研究 ,结果表明 ,1.5～2 .0mm茎尖在含有 0 .3、0 .5和 0 .7mol·L-1蔗糖的改良MS培养基 (KNO3 和NH4NO3 减半 )上预培养各 1d ,室温(2 0℃ )下装载液 (2mol·L-1甘油 ,0 .4mol·L-1蔗糖 )停留 2 0min ,0℃下玻璃化液 (PVS2 或PVS3 )处理 30～ 4 0min ,投入液氮保存 1d后 ,4 0℃水浴化冻 1min ,含蔗糖 1.2mol·L-1的改良MS培养基洗涤 2 0min ,接种于含 0 .2mg·L-1CPPU、1mg·L-1BA、0 .0 5mg·L-1IAA、5 0 0mg·L-1可溶性PVP、30g·L-1蔗糖和 7g·L-1琼脂的改良MS培养基 (再生培养基 )表面的滤纸上 ,暗处理 1d后转移到新鲜的上述再生培养基中 ,暗培养 1周后转到正常光下 ,成活率高达 70 .2 % ,再生植株生长和分化正常。本研究结果为柿种质的长期保存提供了新途径。

冷冻环玻璃化法与程序冷冻法对人囊胚冷冻复苏效果的比较

目的比较冷冻环玻璃化法与程序冷冻法对人囊胚冷冻复苏的效果。方法将接受体外受精-胚胎移植患者的剩余胚胎进行培养,所获得的囊胚分别进行程序冷冻法或冷冻环玻璃化法冷冻,比较囊胚复苏后的复苏率、妊娠率等指标。结果玻璃化冷冻复苏39个周期,115个囊胚、存活104个(90.4%),移植38个周期、74个囊胚,临床妊娠28个周期(73.7%),其中2例流产,2例足月分娩2个正常新生儿,24例继续妊娠。程序冷冻21个复苏周期,87个囊胚、存活37个(42.5%),移植15个周期、28个囊胚,临床妊娠6例(40%),其中流产1例,2例足月分娩3个新生儿,3例继续妊娠。玻璃化冷冻后的囊胚复苏率显著高于程序冷冻,复苏周期移植取消率显著低于程序冷冻,而临床妊娠率则明显高于程序冷冻,均有统计学差异(P<0.05)。但两种方法的流产率没有显著差异。结论使用冷冻环玻璃化法适于人类囊胚的冷冻保存,其复苏率和妊娠率均显著高于传统的程序冷冻法,复苏周期移植取消率低于程序冷冻法。

柿和君迁子试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及再生植株遗传稳定性研究

对柿(Diospyros kaki Thunb.)和君迁子(D. lotus L.)试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及再生植株遗传稳定性进行了研究。结果表明,试管苗在添加有蔗糖0.3 molL-1的改良MS培养基 (KNO3和NH4NO3减半)上,于低温6±1℃下锻炼6周后,切取侧芽茎尖1.5～2.0 mm在含蔗糖0.7 molL-1的改良MS培养基上预培养2 d,室温(20℃)下装载液(2.0 molL-1甘油+0.4 molL-1蔗糖)过渡20 min,0℃下玻璃化液PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4 molL-1蔗糖)处理80 min,换成新鲜的PVS2后投入液氮保存1 d,40℃水浴化冻1 min,含蔗糖1.2 molL-1的改良MS培养基洗涤20 min,接种于含0.2 mgL-1 CPPU、1.0 mgL-1 BA、0.05 mgL-1 IAA、500 mgL-1 可溶性PVP、30 gL-1蔗糖和7 gL-1琼脂的改良MS培养基(再生培养基)的滤纸上,暗处理1 d后转移到新鲜的上述再生培养基中,暗培养1周后转到正常光下,再生率超过30%;再生植株通过细胞学和AFLP标记检测,没有发现核DNA含量、染色体数目和AFLP谱带的改变。该结果为柿属植物种质资源的长期保存提供了理论依据。

玻璃化法超低温保存香石竹种质资源的研究

以香石竹"云恋蝶"离体茎尖为试材,研究玻璃化法对香石竹茎尖的离体超低温保存。通过正交设计试验对影响存活率的主要因素(预培养培养基中蔗糖浓度、预培养时间、装载时间和PVS2处理时间)进行分析,结果表明,预培养1 d,预培养基中蔗糖浓度为0.5 mol/L,装载40 min,PVS2液处理40 min,液氮处理1 d,在40℃水浴化冻后的香石竹茎尖,成活率达44.13%,且超低温再生苗与其常温苗的生理生化指标无显著差异。本试验成功地建立了香石竹种质资源玻璃化法超低温保存的技术,为香石竹种质资源的长期保存提供了一条有效途径。