企鹅珍珠贝热休克蛋白70基因的克隆与序列比较分析

采用同源克隆和锚定PCR技术,从企鹅珍珠贝Pteria penguin中克隆到热休克蛋白hsp70基因的cDNA全序列。cDNA全长2 308 bp,3’非编码区域(UTR)为234 bp,5’UTR为118 bp,开放阅读框(ORF)为1 956 bp,编码651个氨基酸,分子量为70.97 kd,理论等电点为5.24,有2个糖基化位点:NKSI和NVSA,并含有HSP70家族的3个签名序列:IDLGTTYS,DLGGGTFD和IVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端的保守序列EE-VD。结合BLAST分析的结果,可以确认获得的cDNA序列为企鹅珍珠贝HSP70的编码序列。与合浦珠母贝Pinctada fucata hsp70的氨基酸序列相比,企鹅珍珠贝多1个糖基化位点NVSA,少1个氨基酸,包括1个氨基酸插入和2个缺失。两者的氨基酸序列一致性高达92%,突变位点52个;两者的核苷酸序列一致性高达79%,突变位点416个。系统发育分析表明两者的亲缘关系最近,与传统分类相符,然后与太平洋牡蛎等聚合在一起。该基因的克隆和比较分析为进一步深入研究珍珠贝类的抗逆机理、抗性育种及其进化具有重要意义。

企鹅珍珠贝游离珠插核效果的初步观察

借鉴马氏珠母贝插核技术培育企鹅珍珠贝 (Pteria(Magnavicula) penguiRoding)游离珠时 ,死亡率为23% ,留核率为11.1 % ,死亡高峰出现在施术后的第2～7天 ,脱核高峰出现在施术后第2～10天 ,生理状态在施术后17d左右进入稳定期 ,70～90d后基本恢复 ,可结束休养进入珍珠育成。另外 ,为提高成珠率和成活率 ,植核用贝要经人工养殖驯化 ,采用开放式与笼养相结合的养殖方式 ;术后可采用室内与海区相结合的休养方式。

基于线粒体16S rRNA基因序列对3种珍珠贝的鉴定

传统的形态鉴定主要依赖于分类者的经验和水平,容易产生分类错误。为提高物种鉴定的准确性,作者采用形态学与线粒体16S rRNA基因序列分析相结合的方式对广西北海涠洲岛采获的3种珍珠贝进行了鉴定。研究结果表明,基于形态学可将3种珍珠贝分别鉴定为企鹅珍珠贝(Pteria penguin)、宽珍珠贝(P.loveni)和中国珍珠贝(P.chinensis),但基于16S r RNA基因序列,形态学鉴定为P.loveni的标本应为P.lata。P.loveni和P.lata是两个完全独立的种,并非为同物异名。珍珠贝属16S rRNA基因序列的种间遗传距离明显大于种内遗传距离,适宜作为该属种类鉴定的分子标记。在基于16S r RNA基因序列构建的系统树中,相同种类的不同个体均形成单系群,并获得很高的支持率。分布于中国沿海的珍珠贝属种类应包括P.lata,是否有P.loveni的分布尚需进一步证实。

7种珍珠贝RAPD鉴别标记的初步研究

采用RAPD分子标记技术对珠母贝属的大珠母贝、珠母贝、黑珠母贝、白珠母贝、合浦珠母贝、长耳珠母贝和珍珠贝属的企鹅珍珠贝的基因组DNA的特异性遗传标记进行分析。从21个OPM和S系列中筛选出4个引物，共扩增出57个位点，每条引物平均产生14．3个位点。扩增片段大小在250-2000bp间，平均每种贝每条引物产生4．9条带。其中引物S10对7种珍珠贝的RAPD产物呈现出物种的特异性，可同时将7种珍珠贝分开，其余引物可以将2种或2种以上的珍珠贝区别开来。引物S10可以作为种间鉴定的标记。

企鹅珍珠贝Dmrt2基因的克隆及表达分析

本研究利用RACE-PCR技术获得企鹅珍珠贝(Pteria penguin)一个Dmrt2基因cDNA的全长序列,通过荧光定量PCR分析Dmrt2基因在各组织中的表达特征,以及在早期卵巢、成熟期卵巢、早期精巢、成熟期精巢和排放期精巢中的表达变化。结果表明,Dmrt2基因全长1 257bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)为951 bp,编码316个氨基酸,5′非编码区(untranslated region,UTR)为52 bp,3′UTR为254 bp,第20位到第73位氨基酸为DM结构域。预测其分子质量为36.61ku,等电点为9.80。氨基酸序列比对显示该企鹅珍珠贝Dmrt2基因与黑蝶真珠蛤(Pinctada margaritifera)和马氏珠母贝(Pinctada martensii)的Dmrt2基因同源性(identity)最高,分别为46.0%和45.7%。其中在DM结构域高度同源。荧光定量PCR分析组织表达特征显示,Dmrt2在企鹅珍珠贝的外套膜、鳃、消化盲囊、足、精巢和卵巢均有表达,其中在精巢中表达量最高(P<0.05),足为其次,在闭壳肌中没有检测到Dmrt2表达。对性腺发育不同时期的表达量分析发现,Dmrt2在发育早期和成熟期卵巢中表达量都很低,在发育早期精巢中表达量较高,在成熟期精巢检测到最大表达量(P<0.05),到精巢排放期表达显著下降,推测Dmrt2可能与企鹅珍珠贝精巢的发育有关,可能参与了企鹅珍珠贝雄性性别分化和性腺发育这一生理过程。