珍贵束丝放线菌固体发酵生产安丝菌素及安丝菌素P-0制备

目的获得安丝菌素及安丝菌素P-0纯品。方法珍贵束丝放线菌ATCC 31565经固体发酵培养,培养物乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析后得到安丝菌素P-2、P-3和P-4混合物。安丝菌素混合物经化学法脱去C-3酰基侧链,采用制备型HPLC获得安丝菌素P-0纯品。结果每升固体发酵培养基可获得安丝菌素P-2、P-3和P-4混合物(98±2)mg(纯度85%)。50mg该安丝菌素样品可获得安丝菌素P-0纯品约31mg(纯度大于99%),产率约82%。结论将安丝菌素固体发酵培养与提取、去酰基化和HPLC纯化相结合,建立了一套安丝菌素P-0纯品的实验室制备工艺。

珍贵束丝放线菌产生的新代谢产物1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯

目的发现珍贵束丝放线菌ATCC 31565产生的新代谢产物。方法TLC和LC-MS等分析珍贵束丝放线菌ATCC 31565培养物的乙酸乙酯提取物,发现目标化合物。采用MCI色谱柱和半制备HPLC等分离纯化目标化合物。对目标化合物的NMR等数据进行分析,确定其化学结构。结果从珍贵束丝放线菌ATCC 31565中发现了一个化学结构为1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯的新化合物,并将其命名为珍贵酚。结论推测珍贵酚是1,4-二羟基-2-萘甲酸(甲萘醌的生物合成前体物)和L-鼠李糖这两个初级代谢产物的脱水缩合产物再经过甲酯化形成的。

珍贵橙色束丝放线菌固体发酵合成安丝菌素P-3的工艺探索

为了探索珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum)合成安丝菌素P-3(AP-3)的固体发酵培养条件的最佳工艺,利用农副产品(玉米淀粉、玉米粉、棉籽饼粉、豆粕、豆饼粉、菜籽饼粉、麦麸、米糠)作为固料,采用单因素实验和正交实验对固体发酵培养基组成及培养条件进行摸索。得到合成AP-3固体发酵的最佳培养基组分为:玉米淀粉、豆粕及棉籽饼粉的质量配比为1∶1∶1,红糖4%,玉米浆干粉2%,CaCl2 1%。最佳固体发酵工艺条件为:初始pH为7.5,培养温度28℃,固液比(质量比)为1∶0.8,装量25g(250mL锥形瓶),接种量150mL/kg,培养时间为7天,最优条件下AP-3的产量为(26.86±1.87)mg/kg(每千克培养基)。本研究为发酵合成安丝菌素提供了新的方法与思路。

珍贵橙色束丝放线菌中新颖香草酰氨鼠李糖糖苷化合物(英文)

从珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)的琼脂平板发酵产物中分离得到一个新的糖苷化合物,通过理化性质和谱学分析(MS、1D-NMR、2D-NMR)确定为香草酰氨4-O-鼠李糖苷(3-甲氧基4-O-鼠李糖苷-苯甲酰胺)。

基因组重排提高珍贵橙色束丝放线菌中安丝菌素P-3

安丝菌素P-3(ansamitocin P-3,AP-3)是一种具有高抗肿瘤活性的安莎类抗生素,为了进一步提高AP-3高产菌的产量,开展了利用基因组重排技术提高AP-3发酵水平的研究。首先对AP-3生产菌珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)原生质体制备、处理、融合条件进行了初步优化,然后以常温常压等离子体(atmospheric room temperature plasma,ARTP)诱变技术得到的高产菌株L-40、L-117、L-506、L-522作为出发亲本进行三轮基因组重排,通过高通量筛选最终筛选出一株高产融合子G3-96,其AP-3产量约为335.9 mg/L,该菌株AP-3产量比亲本提高了47.5%,比野生型菌株提高了93.8%。实验结果表明基因组重排对于产物产量的提升是个非常不错的策略,为发酵生产合成提供了良好的菌株基础。

珍贵橙色束丝放线菌生产安丝菌素P-3的发酵工艺

将安丝菌素P-3(1)产生菌珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)的紫外诱变高产菌株A.pretiosum SIPI-U-7 6,通过5 L发酵罐进行小试工艺研究,表明搅拌剪切力对1产量有明显的影响。采用降低搅拌转速、减少种子培养时间和调整发酵配方的方法,在5 L发酵罐上1的发酵单位可优化达到378 mg/L。将优化后的小试工艺放大至500 L和1 000 L罐上,发酵单位分别达到288和317 mg/L,较未优化的5 L发酵罐上的1发酵单位(23 mg/L)提高了11.5倍和12.8倍,实现了1的规模化生产。

双组分转导系统CNX_RS34865/CNX_RS34870对安丝菌素生物合成的调控机制研究

目的探究珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中双组分转导系统CNX_RS34865/CNX_RS34870对A.pretiosum中安丝菌素P-3(AP-3)生物合成的调控机制。方法本研究以A.pretiosum X47菌株为出发菌株,构建双组分转导系统CNX_RS34865/CNX_RS34870中调控基因CNX_RS34870的缺失突变菌株;利用HPLC分析及生物活性测定分析出发菌株X47与CNX_RS34870突变菌株(ΔRS34870)的AP-3产量差异;利用转录组测序分析菌株之间各基因的转录水平差异,分析CNX_RS34870对菌株AP-3生物合成的影响及作用机制。结果与出发菌株X47相比,ΔRS34870菌株在液体发酵条件下AP-3生物合成量显著下降,在第6天时,ΔRS34870菌株AP-3产量降低了36.94%。转录水平分析显示ΔRS34870菌株中1524个基因的转录较X47明显不同,其中AP-3生物合成基因簇中的asm1、asm2、asm30、asm32、asm33、asm34、asm35和asm37基因以及与初级代谢中与AP-3前体合成相关的pgk基因出现了显著下调。结论CNX_RS34870是菌株AP-3生物合成的正调控基因,可通过调控AP-3生物合成基因簇的转录以及影响初级代谢从而影响AP-3的产生。本研究将为了解AP-3生物合成的调控网络以及工业菌株的遗传改造提供理论指导。

安丝菌素P-3的发酵工艺

考察了珍贵橙色束丝放线菌SIPI-3-21生产安丝菌素P-3(AP-3)的发酵工艺。首先优化了摇瓶发酵培养基配方,在含葡萄糖20.0 g/L、玉米淀粉30.0 g/L、棉籽饼粉30.0 g/L、CaCl2 10.0 g/L和CaCO3 5.0 g/L的发酵培养基中发酵培养9 d,AP-3产量为123.2 mg/L。进一步在摇瓶中考察了前体异丁醇对AP-3合成的影响,结果表明,添加异丁醇可以显著提高AP-3的产量。当其添加浓度为54 mmol/L时,AP-3的产量为307.8 mg/L,同时发酵液中AP-3的含量从57.2%提高到86.5%。

适应性进化与甜菜碱的添加促进安丝菌素的生产

【背景】安丝菌素是一类由珍贵束丝放线菌橙色亚种(Actinosynnema pretiosum ssp.auranticu)生产的美登素类衍生抗生素,属于大环内酰胺类物质,根据不同的C-3位基团可以分为一系列衍生物。目前已上市的高效抗癌药物曲妥珠单抗(T-DM1)以AP-3 (Ansamitocin P-3)为生产底物,并表现出很好的乳腺癌治疗效果。然而当前AP-3的产量较低,其过高的成本限制了进一步发展。【目的】应用适应性进化及添加适量甜菜碱策略提高安丝菌素AP-3的产量。【方法】以珍贵束丝放线菌橙色亚种为出发菌株,链霉素和巴龙霉素为胁迫压力进行适应性进化,筛选出安丝菌素积累较高的菌株,随后向进化菌株的发酵培养基中添加0.1%的甜菜碱,AP-3的产量进一步提高,同时分析了进化菌株AP-3相关基因的转录水平,初步探索进化菌株安丝菌素积累提高的原因。【结果】得到2株进化菌株Str16-4-4和Par16-2-1,发酵7d后AP-3产量分别提高了33.4%和31.7%,添加甜菜碱后其AP-3产量相比出发菌株提高了54.6%和47.4%。【结论】通过适应性进化的策略获得了AP-3生产能力提高的珍贵束丝放线菌橙色亚种进化菌株,对促进AP-3的生产提供了新思路,而且为适应性进化策略提高目标产物的产量提供了新的例证。