琥珀酰化修饰对马氏珠母贝植核免疫的影响

【目的】研究蛋白质琥珀酰化修饰在马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)植核后免疫应答中的作用,为阐明珍珠贝植核反应的分子调控机制提供理论依据。【方法】通过对马氏珠母贝注射琥珀酸钠模拟提高琥珀酰化修饰水平,检测马氏珠母贝植核后鳃组织总蛋白琥珀酰化程度、免疫相关基因表达、抗氧化相关酶酶活以及珍珠贝的存活率和留核率。【结果与结论】注射琥珀酸钠后,鳃组织琥珀酰化修饰水平在12 h和72 h显著上升;使用实时荧光定量PCR检测胁迫应激相关基因的时序表达,胁迫应激相关因子SOD和Caspase2在6 h表达量显著上调,NF-κB和IRAK1在48 h表达量显著上调,TRAF3和IκK的表达量在96 h显著上调(P <0.05),表明琥珀酰化修饰水平提高后受体贝机体细胞免疫增强;抗氧化相关酶、过氧化物酶和谷胱甘肽活性都在96 h出现显著上调(P <0.05),表明受体贝体液免疫增强。与对照组[磷酸盐缓冲溶液(PBS)+植核]和植核组相比,实验组(琥珀酸钠+植核)中珍珠贝的存活率在7 d和45 d存在显著差异,在60 d留核率显著上升(P <0.05)。结果说明,琥珀酰化修饰参与了马氏珠母贝的植核免疫反应,注射琥珀酸钠可以提高受体贝的免疫活力,并提高其在植核后的存活率和留核率。

低渗诱导合浦珠母贝的三倍体

为了探究不同盐度对诱导合浦珠母贝三倍体的效果,本研究首次利用低渗方法诱导合浦珠母贝三倍体,通过控制变量法从不同盐度、诱导时机以及诱导时间中探究最适诱导条件。同时对合浦珠母贝卵裂率、孵化率以及存活率、壳长、三倍体率的变化进行了探究。结果显示,在盐度14、50%受精卵释放第一极体(PBⅠ)及诱导15 min时D形幼虫的三倍体率最高,分别为64.16%±6.92%、65.87%±6.51%以及65.14%±1.93%。三倍体幼虫并未表现出明显优势;低渗对胚胎造成的影响使幼虫存活率和三倍体率有所下降。通过对卵裂率、孵化率和15日龄存活率、壳长及三倍体率进行主成分分析,在三种诱导条件中均保留了前两个主成分,且保留的主成分的累积方差贡献率均超过了85%。盐度14、50%受精卵释放PBⅠ及诱导15 min分别在各自实验中的综合评价得分分别为第6、第1和第1。该研究表明,合浦珠母贝三倍体幼虫在生长方面的优势不明显,50%受精卵释放PBⅠ及诱导15 min两个诱导条件适合合浦珠母贝三倍体诱导。本研究可为合浦珠母贝三倍体育种提供一种新的思路,有助于提高生产效益。

马氏珠母贝Perlucin基因序列特征及其SNP与耐低温性状的关系

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)新的凝集素分子基因,命名为Perlucin,研究在低温胁迫下马氏珠母贝Perlucin的表达以及与抗低温性状相关的单核苷酸多态性(SNP)位点。【方法】根据马氏珠母贝基因组中Perlucin基因序列设计引物,克隆Perlucin基因全长;用生物信息学方法分析Perlucin的结构和理化特征;设计17和22℃(对照)2个温度组,对马氏珠母贝进行低温胁迫实验,用实时荧光定量PCR检测低温胁迫下Perlucin表达量的变化;筛选和比较分析马氏珠母贝耐低温选育系(R)F3和北部湾野生群体(W)的Perlucin外显子区的SNP位点和单倍型。【结果】马氏珠母贝Perlucin全长631 bp,编码152个氨基酸;包含1个信号肽和1个C型凝集素结构域。同源分析表明,马氏珠母贝Perlucin与紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)Perlucin的亲缘性最近。Perlucin在鳃中表达量最高,其次为足和肝胰腺。低温胁迫时,鳃组织中Perlucin基因在17℃低温组的表达量呈先升高后降低的趋势,在12 h时达到最高并显著高于22℃对照组(P<0.05),表明Perlucin可能参与马氏珠母贝的低温响应过程。对Perlucin外显子区的SNP进行分析,共得到30个SNP,其中13个SNP位点的基因型频率在R和W群体间差异显著(P<0.05)。【结论】Perlucin是参与调节马氏珠母贝低温适应过程中的候选基因,筛选出两个SNP位点g.40078856、g.40078945。

急性低氧胁迫对马氏珠母贝生长、免疫及矿化相关基因表达的影响

【目的】探究急性低氧胁迫对马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)生长、免疫及矿化相关基因表达的影响,为马氏珠母贝抗逆品系选育提供参考。【方法】将马氏珠母贝从常氧条件下移至2 mg·L^(-1)低溶解氧水体,比较其在低氧胁迫0、12、24和48 h时免疫与抗氧化相关基因(caspase-3、HSP90、CAT和SOD)、生长相关基因(EGFR、FGF18、OSR1和tgfbr1)和矿化相关基因(pif177、aspein、nacrein和TIMP)的表达水平。【结果】急性低氧胁迫后,HSP90的表达水平12 h时低于对照组(P <0.05),caspase-3和CAT的表达在胁迫24 h时显著增加(P <0.05),而SOD的表达无明显变化(P> 0.05);矿化相关基因pif177、aspein、nacrein在急性低氧胁迫后的表达均显著降低,TIMP仅在12 h时显著降低(P <0.05);生长相关基因EGFR、FGF18和OSR1基因的表达也出现显著下降(P <0.05),tgfbr1的表达在24 h时显著高于对照组(P <0.05)。【结论】急性低氧胁迫上调免疫与抗氧化相关基因中caspase-3、CAT的表达,抑制HSP90的表达,抑制矿化相关基因的表达,抑制生长相关基因中EGFR、FGF18和OSR1的表达,上调tgfbr1的表达。

马氏珠母贝TNFR27基因克隆与功能初探

为了探究肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)基因在马氏珠母贝中的免疫应答机制,本实验采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了马氏珠母贝TNFR27(PmTNFR27)基因cDNA全长并进行生物信息学分析,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了马氏珠母贝在脂多糖(LPS)、聚肌胞苷酸[Poly(I:C)]及镉胁迫后,PmTNFR27 mRNA在其不同组织中的表达模式。结果显示,PmTNFR27 cDNA全长为1524 bp,5′UTR长为186 bp,3′UTR长为248 bp,包含28 bp的poly(A)尾巴,开放阅读框(ORF)为1062 bp,编码353个氨基酸;结构域预测表明PmTNFR27具有一个典型的CRD结构域和一个跨膜蛋白结构域,符合肿瘤坏死因子受体超家族特征;多序列比对结果显示,贝类种间的相似性不高,但功能结构域位置较保守。系统进化树结果显示,马氏珠母贝与其他贝类聚为一支。qRT-PCR结果显示,PmTNFR27 mRNA在马氏珠母贝各组织中均有表达,在鳃中相对表达量最高。LPS刺激后,PmTNFR27基因在鰓中的相对表达量于3 h显著上升并达到最高值,于72 h降到最低值,最高值约为最低值的9.67倍;Poly(I:C)刺激后,PmTNFR27基因在鰓中的相对表达量在6、12 h显著上升并达到最高值,至96 h时降到最低值,最高值约为最低值的13.16倍。镉胁迫后,3 h相对表达量达到最高,24、48 h相对表达量显著下降。研究表明,PmTNFR27可能参与了马氏珠母贝的免疫应答反应。本研究可为进一步探究TNFR在贝类中的生物学功能提供重要的理论基础和参考价值。

马氏珠母贝V-ATPase-d基因序列特征及其与耐低温性状的关系

液泡ATP酶(V-ATPase)在生物应对各种环境压力时发挥重要功能,为探究VATPase在马氏珠母贝低温适应过程中的作用,实验克隆了马氏珠母贝的V-ATPase-d基因,采用qRT-PCR技术研究了低温胁迫下Pm-V-ATPase-d表达量的变化,并筛选和比较了该基因在耐低温选育系(low temperature resistant line,R)F_(3)和北部湾野生群体(Beibu Gulf wild population,W)外显子区的SNP位点。结果显示,Pm-V-ATPase-d总长为1473 bp,开放阅读框(ORF)为1140bp,编码379个氨基酸,具有ATP典型的结构域PfamvATPsynt_AC39。Motif分析及三级结构预测结果表明,Pm-V-ATPase-d具有较高的保守性,其在系统进化树中与长牡蛎聚为一支。组织荧光定量结果显示,Pm-V-ATPase-d在所检测的组织中均有表达,在肝胰腺、性腺和鳃组织中表达量较高。在低温胁迫条件下,Pm-VATPase-d基因的表达量随着时间的延长呈现先上升后下降的趋势,且低温组的表达量在5 d内均显著高于对照组,这表明Pm-V-ATPase-d可能参与了马氏珠母贝对温度胁迫的响应;对Pm-V-ATPase-d外显子区的SNP分析共得到35个SNP,其中34个为同义突变,只有一个位点为非同义突变,26个SNP在W和R群体的不同基因型和等位基因之间具有显著差异,单倍型连锁不平衡分析结果显示,Pm-V-ATPase-d基因SNPs可形成6个单倍体块,14种单倍型,其中单倍型GAAT、CGC、TC、TG、AG与马氏珠母贝耐低温性状显著相关。研究表明,Pm-V-ATPase-d可能是参与调节马氏珠母贝低温适应过程中的候选基因,本研究可为马氏珠母贝对低温的适应机制提供研究基础,筛选出的与抗低温性状相关的SNPs及单倍型可应用于分子辅助育种。

3种重金属离子对马氏珠母贝急性毒性研究

开展了不同质量浓度铜离子(Cu^(2+))(0.000,0.100,0.117,0.134,0.151,0.168和0.185 mg/L)、锌离子(Zn^(2+))(0.000,3.670,4.000,4.330,4.660,4.990和5.320 mg/L)、镉离子(Cd^(2+))(0.000,3.000,4.000,5.000,6.000,7.000和8.000 mg/L)对马氏珠母贝(Pinctada fucata martensiii)96 h的急性毒性试验。结果表明,Cu^(2+)、Zn^(2+)、Cd^(2+)质量浓度与马氏珠母贝死亡率(96 h)的回归方程分别为:y=853.782x-88.997(R^(2)=0.9844)、y=54.372x-192.070(R^(2)=0.9677)、y=20.886x-62.705(R^(2)=0.9802),Cu^(2+)、Zn^(2+)、Cd^(2+)对马氏珠母贝的半致死浓度分别为:0.163,4.452和5.396 mg/L;安全浓度分别为0.016,0.445和0.540 mg/L;3种重金属离子的毒性从高到低依次为:Cu^(2+)、Zn^(2+)、Cd^(2+)。指出,马氏珠母贝对Cu^(2+)最为敏感,需要重点关注养殖环境中的Cu污染。

珍珠母肽酶解工艺的优化及对人肝癌细胞HepG2能量代谢的影响

该研究以水解度为指标,仿生酶用量、提取时间、提取温度为条件因素,设计Box-Behnken响应方案,对珍珠母肽酶解条件进行优化;同时研究其不同质量浓度的珍珠母肽对HepG2肝癌细胞的抑制作用的影响。最佳酶解工艺条件为:温度55℃,调节pH值为2.0,加入胃蛋白酶质量分数1%,酶解2.6 h后,pH值调节为8.0,加入胰蛋白酶质量分数1.7%,酶解3 h,此时珍珠母肽水解度为31.21%;基于此酶解条件获得珍珠母肽进行对肝癌细胞抑制作用,研究实验结果显示不同质量浓度珍珠母肽(12.5、25、50、100、200μg/mL)与氯化钴(CoCl_(2))诱导的HepG2肝癌细胞缺氧模型相比较,均可抑制细胞存活率,珍珠母肽中氨基酸结果显示,精氨酸可能参与抑制肝癌细胞增殖,从能量代谢的角度说明珍珠母肽可通过减少三磷酸腺苷的生成和降低乳酸、己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶能量代谢关键酶活力达到抑制HepG2细胞增殖的目的,可为珍珠母肽的制备工艺提供参考,为其开发利用提供一定的理论基础。

大型海藻对马氏珠母贝养殖尾水的净化效果

为研究大型海藻石莼、线形硬毛藻、总状蕨藻对马氏珠母贝养殖尾水的净化效果,试验设计了4个处理组,分别为对照组、石莼组、线形硬毛藻组、总状蕨藻组,并模拟马氏珠母贝养殖尾水,对模拟养殖尾水中总磷(TP)、总氮(TN)、铵态氮(NH_(4)^(+)-N)的处理效果进行研究。测量时,每组重复3次,每次取水量为5 mL。试验结果表明:石莼组对TN、NH_(4)^(+)-N的去除率均高于其他处理组;试验结束时,石莼组、线形硬毛藻组、总状蕨藻组对TP、TN、NH_(4)^(+)-N的去除速率明显高于对照组。总体来看,石莼组在马氏珠母贝养殖尾水处理中的效果较好。

陆基工厂化环境下基于干藻粉投喂马氏珠母贝可行性分析

2023年开始在车间内开展陆基工厂化环境下基于干藻粉投喂马氏珠母贝可行性研究,该研究尝试将海水引入车间,搭建工厂化养殖环境,通过混合投喂多种干藻粉来观察珍珠贝的生长情况。结果显示,以螺旋藻、小球藻为主食,轮虫粉为辅食,养殖3个月的时间,通过3个养殖池的对比试验,存活率最高的二号池能达到72.6%(如果将寒潮期细菌感染死亡数量剔除,存活率能达到82.4%)。表明用干藻粉投喂马氏珠母贝,可大幅降低珍珠养殖成本,能基本解决存活问题。

珍珠、珍珠母、珍珠贝肉、珍珠母液的化学成分及其生物活性的研究进展

珍珠、珍珠母、珍珠贝肉、珍珠母液是由多种有机物、无机物构成,包括微量元素、氨基酸、维生素、多糖、多肽等物质,因此具有多种生物活性,如成骨活性、抗氧化活性、促进成纤维细胞迁移、改善记忆障碍、抗惊厥和镇静催眠、抗炎和抗凋亡、增强免疫力等作用。故本文针对近年来珍珠、珍珠母、珍珠贝肉、珍珠母液的化学成分、生物活性的研究进展进行综述,旨在为珍珠的进一步研究和开发利用提供依据。

马氏珠母贝CD-MPR基因序列特征及其在耐低温品系的选择分析

【目的】明确马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CD-MPR)基因(PmCD-MPR)多态性与其低温耐受能力的相关性,为马氏珠母贝耐低温品系的选育提供理论依据。【方法】采用RACE克隆PmCD-MPR基因序列全长,并运用实时荧光定量PCR检测PmCD-MPR基因在马氏珠母贝各组织及低温胁迫下的表达模式;基于马氏珠母贝耐低温选育系(R群体)和北部湾野生群体(W群体)的全基因组重测序数据筛选出PmCD-MPR基因外显子区的SNP位点,并通过遗传多态性分析、单倍型分析及频率计算获取与马氏珠母贝低温胁迫过程相关的SNP位点。【结果】PmCD-MPR基因序列全长902 bp,其开放阅读框(ORF)为792 bp,共编码263个氨基酸残基;PmCD-MPR基因编码蛋白分子量为30.22 kD,理论等电点(pI)为5.79,属于亲水性蛋白,在第18~263位氨基酸处含有1个典型的甘露糖-6-磷酸受体(Man-6-P_recep)结构域。CD-MPR氨基酸序列在N端的相似性较低,在C端的相似性较高;基于CD-MPR氨基酸相似性构建的系统发育进化树显示,马氏珠母贝与长牡蛎、加利福尼亚海兔等软体动物聚为一支,与经典的动物学分类相吻合。PmCD-MPR基因在马氏珠母贝肝胰腺的相对表达量最高,显著高于在性腺、闭壳肌和外套膜中的相对表达量(P<0.05,下同);低温胁迫组马氏珠母贝鳃组织中的PmCD-MPR基因相对表达量随着胁迫时间的延长整体上呈先上升后下降的变化趋势。从PmCD-MPR基因外显子区筛选获得34个SNPs位点,且这34个SNPs位点构成5个单倍块和15种单倍型,其中GCC、TG、CCCTCT等3种单倍型在R群体中的分布频率显著高于W群体,即与马氏珠母贝耐低温性状显著相关。【结论】PmCD-MPR基因参与马氏珠母贝的低温响应过程,与耐低温性状显著相关的基因型及单倍型可作为马氏珠母贝耐低温品系辅助育种的候选分子标记。

马氏珠母贝组蛋白乙酰化修饰相关基因的分子进化及功能分析

【目的】分析组蛋白乙酰化修饰相关基因的分子进化及其在马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)植核后的表达变化,明确组蛋白乙酰化修饰在植核免疫中的作用,为合理控制植核免疫反应提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析方法对马氏珠母贝、长牡蛎、斑马鱼及人类等9个物种的组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)进行全基因组鉴定,并分析其分子进化历程,同时通过已有的转录组数据分析马氏珠母贝HAT和HDAC基因在植核后的表达变化,采用组蛋白H3/H4总乙酰化定量分析试剂盒检测马氏珠母贝植核后血细胞组蛋白H3/H4乙酰化水平。【结果】HAT和HDAC基因家族在9个物种基因组中的数目差异不明显,其原始共同祖先(MRCA)共包含8个HAT基因家族的9个基因及19个HDAC基因家族的22个基因。马氏珠母贝基因组含有2个HAT家族(GNAT和MYST)的8个基因(2个GNAT类基因,6个MYST类基因);HAT基因家族成员中含有18个保守氨基酸序列,且所有MYST类基因均含有MOZ_SAS结构域,GNAT类基因则含有Hat1_N或Acetyltransf_1结构域,即具有较高的保守性。马氏珠母贝基因组含有13个HDAC家族的18个基因,包含3个I类、3个II类、10个Ⅲ类和2个IV类。其中,HDACⅢ类基因家族包含3个保守氨基酸序列,HDAC I/II/IV类基因家族包含21个保守氨基酸序列,但分布位置和序列组成差异明显,说明该家族成员结构具有多样性。马氏珠母贝、长牡蛎和人类中HDACⅢ类基因均包含1~2个SIR2结构域,HDAC I/II/IV类基因包含1个或多个Hist-deacety1结构域。在马氏珠母贝血细胞转录组中可检测到所有的HDAC和HAT基因,HDAC基因在植核后的表达呈动态变化,而多数HAT基因表达未发生变化;植核后6、12和24 h马氏珠母贝血细胞组蛋白H3和H4的乙酰化修饰水平显著上升(P<0.05),至植核后48 h组蛋白H3仍保持较高乙酰化水平,而组蛋白H4乙酰化水平恢复正常。【结论】组蛋白乙酰化修饰相关基因的基因组拷贝数、结构域组成及保守氨基酸序列等在不同物种间具有保守性,且组蛋白乙酰化修饰参与调控马氏珠母贝的植核免疫。

茶多酚对马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养的影响

为改善马氏珠母贝(Pinctada martensii)外套膜组织和细胞体外培养的效果,探究了添加不同浓度的天然提取物茶多酚对外套膜组织和细胞培养液的优化效果。结果显示,当茶多酚的添加量为0.5%~2.0%(体积分数)时,马氏珠母贝外套膜细胞的生物活性显著高于对照组(P<0.05);当添加量为1.0%时,相对细胞生物活性最高。5组完全培养液(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%组)均能较好地促进细胞的生长增殖,且细胞的生长曲线均呈“S”型;当培养液中茶多酚的添加量为1.0%时,外套膜细胞增殖效果最优。研究表明,马氏珠母贝外套膜组织和细胞在最适培养液中均能大量增殖游离细胞,且正常分泌珍珠质,其中培养液中的钙离子(Ca^(2+))浓度随着组织和细胞增殖过程呈先减后增的趋势,但始终低于初始浓度。研究结果进一步优化了马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养液,为推动马氏珠母贝无核珍珠的培育提供了理论基础。

马氏珠母贝α-Tubulin基因结构、SNP筛选及耐低温相关性分析

为了探究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)α-Tubulin基因在低温适应性中的作用,通过RACE克隆技术获得马氏珠母贝α-Tubulin基因,分析了α-Tubulin基因在低温胁迫下的表达趋势,并筛选和比较了马氏珠母贝耐低温选育系(R)F3和北部湾野生群体(W)的α-Tubulin编码区SNP位点。结果表明:马氏珠母贝α-Tubulin基因总长为2107 bp,可编码454个氨基酸,具有典型的Tubulin和Tubulin-C结构域;全组织定量显示,α-Tubulin基因在所有组织中均有表达,在足部中表达量最高(P<0.05);低温胁迫时,鳃组织中α-Tubulin基因在低温组(12、17℃)的表达量均在72 h时达到最高,且显著高于对照组(22℃)(P<0.05);α-Tubulin外显子区域共有34个SNP,其中3个SNP位点的基因型频率在R和W群体间有显著性差异(P<0.05);连锁不平衡分析显示,R群体单倍型CCTCAGCGCC的频率明显高于W群体。研究表明,α-Tubulin为参与调节马氏珠母贝低温适应过程中的候选基因,筛选出的与抗低温性状相关的SNP位点g.111071125及优异单倍型CCTCAGCGCC,可作为选择育种的候选标记。

广西合浦珠母贝3个不同群体遗传关系分析

为探索广西合浦珠母贝群体内杂交组合方式,分别从北海野生群体(F_(1))、选育群体(F_(4))和养殖群体中随机挑选2龄种贝样本15个,进行简化基因组测序,通过单核苷酸多态标记解析3个群体的遗传关系。研究结果显示,获得超过585000个单核苷酸多态标记,野生群体、选育群体和养殖群体的观测杂合度分别为0.1975、0.1679和0.1783,期望杂合度分别为0.2545、0.2469和0.2732,平均近交系数分别为0.2075、0.3449和0.3465,多态信息含量分别为0.2032、0.2089和0.2241,选育群体近交系数与养殖群体相近,野生群体和养殖群体的群体遗传多态高于选育群体。系统进化树和主成分分析显示,选育群体与养殖群体部分样品亲缘关系较近。选育群体和养殖群体之间的遗传分化指数最低,部分亲本同源的可能性较大;野生群体、选育群体和养殖群体的平均长纯合片段数分别为59.1、49.5个和56.6个,长纯合片段平均长度分别为0.312、0.313Mb和0.311Mb,平均单核苷酸多态标记含量分别为59、50和73,近交系数FROH分别为0.0149~0.0240、0.0159~0.0201和0.0170~0.0246,反映3个群体的真实近交水平较低;野生群体、选育群体和养殖群体的整个染色体内连锁不平衡衰减距离分别为0.4、0.4kb和0.2kb(r2=0.2),衰减速度为养殖群体>野生群体>选育群体,选育群体衰减速度最慢,可能与人工选育有关。以上结果表明,广西合浦珠母贝可采用野生群体×选育群体或野生群体×养殖群体的杂交组合方式开展群体内杂交。本研究结果可为广西合浦珠母贝育种中的亲本选择提供参考。

高温胁迫对合浦珠母贝不同群体存活及免疫酶活性的影响

为比较合浦珠母贝(Pinctada fucata)不同群体在高温胁迫下的存活及免疫酶活性变化情况,本实验以“海优1号”(YY)、“海选1号”(XX)、“南科1号”(KK)和广西潜在耐高温养殖群体(TT)为实验材料,通过渐变升温的方式测定4组合浦珠母贝在35℃水温胁迫下的生理指标,研究不同胁迫时长对合浦珠母贝存活及其鳃组织内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)和碱性磷酸酶(AKP)活性的影响。研究显示,实验第8天开始出现个体死亡,TT组在实验12 d后存活率显著高于其余3组(P<0.05);4个群体的SOD、CAT和T-AOC活性随胁迫时间的延长大致呈上升-下降的趋势,在1~24 h内免疫酶活性呈上升趋势,在120 h后下降至对照水平以下;在高温胁迫下各组的AKP活性增加,KK、TT与XX、YY分别在12和24 h达到峰值,在120 h显著下降。本研究初步探明了高温胁迫下合浦珠母贝的免疫应答机制。

马氏珠母贝Rab7基因序列特征及其与耐低温性状的关系

Rab蛋白是膜泡运输过程中的重要调节因子,在囊泡运输和水产动物的免疫应答中行使重要功能。本研究鉴定了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)的Rab7基因(Pm-Rab7),分析了Pm-Rab7在6个组织中及在温度胁迫(低温组17℃、对照组22℃、高温组32℃)下的表达模式,筛选和比较分析了马氏珠母贝耐低温选育系(low temperature resistant line,R) F3和北部湾野生群体(Beibu Gulf wild population,W)的Pm-Rab7外显子区的SNP位点。结果显示,Pm-Rab7序列全长为1 153 bp,5′端、3′端和开放阅读框(ORF)序列长度分别为30、505和618 bp,共编码205个氨基酸;Pm-Rab7具有一个RAB保守结构域,并与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)相似度最高(92.79%)。系统进化树结果显示,Pm-Rab7与太平洋牡蛎等软体动物聚为一支。Pm-Rab7在所检测的组织都有表达,其中在性腺和鳃中的表达显著高于外套膜和肝胰腺等组织(P<0.05)。Pm-Rab7温度胁迫后时序表达分析发现,在17℃低温组,Pm-Rab7的表达量呈先上升再下降的趋势,在6 h~3 d内均显著高于22℃对照组(P<0.05),在1 d时达到峰值;在32℃高温组,Pm-Rab7表达量总体稳定,仅12 h时显著高于对照组(P<0.05),其他时间点与对照组无显著差异(P>0.05);说明该基因的表达与马氏珠母贝对低温胁迫的响应密切相关。Pm-Rab7基因的外显子区域在马氏珠母贝耐低温选育系和北部湾野生群体中共检测到7个SNP位点,其中3个位点的基因型频率在2个群体间具有显著性差异,说明这些位点可能与其耐低温性状相关。结果表明,Pm-Rab7可能在马氏珠母贝耐低温适应过程中发挥重要作用,研究结果可为深入探讨马氏珠母贝对温度变化的环境适应性研究提供参考资料。

马氏珠母贝丝裂原活化蛋白激酶p38的克隆与表达

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白激酶通过磷酸化级联介导的信号通路在细胞对细胞外刺激的反应中起着重要作用。本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得马氏珠母贝MAPK p38(PmMAPK p38)cDNA全长序列并对其序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了PmMAPK p38在马氏珠母贝不同组织以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示,PmMAPK p38 cDNA全长为1516 bp,开放阅读框长度为1071 bp,共编码356个氨基酸,理论分子量为40.88 ku;结构域预测结果表明PmMAPK p38含有MAPK家族典型的S_TKc结构域;多序列比对、进化树构建以及MatGAT计算结果显示PmMAPK p38与其他物种的相似度、保守程度较高;荧光定量分析结果表明,该基因在马氏珠母贝中存在广泛表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为外套膜,最低是闭壳肌。马氏珠母贝在受到LPS刺激后,PmMAPK p38的相对表达量在刺激后2 h达到最高,12 h降到最低,最高约为最低的5倍;而在哈维氏弧菌刺激后,PmMAPK p38的相对表达量在2 h达到最高,8 h降到最低,最高约为最低的4倍。研究表明,PmMAPK p38可能在马氏珠母贝的免疫反应,尤其是在抵御外部细菌侵入中起着重要的作用。本研究为贝类免疫防御系统的研究提供了基础资料。

马氏珠母贝酶解产物品质改良工艺优化

为了得到最佳酶解液呈味特性,以马氏珠母贝酶解产物(EHP)为研究对象,以感官评价、氨基酸态氮含量和挥发性物质为指标,通过单因素试验优化品质改良工艺。结果显示,原料经漂烫处理后,制备的EHP经美拉德反应(蔗糖8%、温度100℃、30 min,pH 7)改良、酵母脱腥(添加量0.5%,40℃,60 min)和气味掩盖法(蒜、姜提取物添加量2%,比例为1∶3)等处理后得到改良后的酶解产物(I-EHP)。与改良前的酶解产物相比,改良后的酶解产物感官评分由17分上升至19.4分,氨基酸态氮由99 mg/100 g下降至74 mg/100 g,游离氨基酸总量下降了49.85%,但鲜味氨基酸增加了7.23%,与电子舌结果相符;气相色谱-质谱联用(GC-MS)结果表明,改良后的酶解产物香气物质种类由72种升至99种,与电子鼻结果相符。因此,优化后的改良工艺有助于改善酶解产物品质。