球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂的影响

为了探究球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂存活率、免疫基因、发育基因及肠道菌群的影响,将纯化培养的球囊菌孢子接种6日龄意大利蜜蜂成年工蜂,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测球囊菌侵染对意大利蜜蜂成年工蜂免疫基因、发育基因及肠道菌群的影响。结果表明,连续3 d接种球囊菌孢子对意大利蜜蜂成年工蜂存活率无显著影响(χ2=0.133,P=0.715)。意大利蜜蜂工蜂中肠与后肠球囊菌孢子含量在接种球囊菌孢子4 d时分别显著高于接种8 d时(P<0.05)。与未接种组相比,接种球囊菌孢子4 d,意大利蜜蜂成年工蜂免疫相关基因abaecin、apidaecin、defensin-1、defensin-2、hymenoptaecin、GNBP-1和IMD均显著上调表达(P<0.05);接种球囊菌孢子8 d,意大利蜜蜂成年工蜂免疫相关基因相对表达量无显著差异(P>0.05);接种球囊菌孢子4 d和8 d,发育相关基因VGMC、usp、kr-h1、AMHex10869相对表达量无显著差异(P>0.05)。与未接种组相比,接种球囊菌孢子4 d,意大利蜜蜂成年工蜂肠道菌群Lactobacillus Firm-4与肠道菌总量U16S rRNA的含量显著上升(P<0.05);接种球囊菌孢子8 d后,肠道菌群Lactobacillus Firm-5的含量显著上升(P<0.05),肠道菌总量U16S rRNA的含量显著下调(P<0.05)。综上,球囊菌侵染不影响意大利蜜蜂成年工蜂的存活率,但会引起意大利蜜蜂成年工蜂的免疫应激反应,影响意大利蜜蜂成年工蜂肠道菌群的稳定及肠道核心菌群的含量。

胁迫意大利蜜蜂幼虫肠道的球囊菌的转录组分析

【目的】本研究旨在通过趋势分析对胁迫意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)幼虫肠道的球囊菌Ascosphaera apis的差异表达基因(DEGs)进行转录组分析。【方法】将纯化的球囊菌孢子配制为1×107孢子/m L的饲料饲喂意蜂3日龄幼虫,利用Illumina Hi Seq 2500平台对球囊菌胁迫的意蜂幼虫肠道c DNA进行测序,将过滤得到的有效读段(clean reads)映射(mapping)到核糖体数据库及意蜂参考基因组,最后将未映射上的reads映射到本课题组组装并注释的球囊菌参考转录组。利用STEM软件对DEGs进行趋势分析。利用WEGO软件对显著表达模式中的DEGs进行GO富集分析。利用Blastall对显著表达模式中的DEGs进行KEGG代谢通路富集分析。最后,通过对随机选取的6个DEGs进行RT-q PCR分析,对RNA-seq数据进行验证。【结果】球囊菌胁迫意蜂幼虫肠道样品的Illumina测序共得到球囊菌的25 454 076条原始读段(raw reads),经过滤得到24 909 820条clean reads,Q30均在93.46%以上。趋势分析结果显示,19 893个DEGs聚类为8个表达模式,其中有12 151个DEGs聚类为3个表现为显著上调趋势的表达模式。GO富集分析结果显示,表现上调趋势的DEGs富集在40个GO term,富集基因数最多的为细胞进程(cellular process)(2 601 unigenes),其次为代谢进程(metabolic process)(2 553 unigenes)和细胞(cell)(2 522unigenes)。KEGG代谢通路富集分析结果显示,上调趋势中的DEGs富集在119个代谢通路上,其中富集基因数最多的是核糖体(ribosome)(213 unigenes),其次为氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)(154 unigenes)和内质网蛋白加工(protein processing in endoplasmic reticulum)(130unigenes)。共有48个DEGs富集在MAPK信号通路上,聚类分析结果显示,这些DEGs随着胁迫时间的延长表达水平逐渐增强。RT-q PCR结果显示,6个DEGs的表达水平变化趋势与RNA-seq数据一致,证明了本研究中的转录组数据真实可靠。【结论】本研究为在分子水平揭示球囊菌的致病机理提供了重要信息,也为阐释球囊菌胁迫意蜂幼虫过程中的病原-宿主互作机制奠定了基础。

影响蜜蜂球囊菌侵染蜜蜂幼虫的因素及侵染过程观察

为探究蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis只侵染封盖前后蜜蜂幼虫的原因及相关侵染机制,本研究利用实验室饲养的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫,给其接种球囊菌孢子,探究不同接种量(0,1.0×102,1.0×103,1.0×104,1.0×105和1.0×106孢子/mL)、接种时期(3,4,5和6龄幼虫)以及28℃低温处理6h对蜜蜂球囊菌侵染的影响。同时对处于不同侵染阶段的蜜蜂幼虫做病理学切片,探究球囊菌侵染的过程。结果显示:球囊菌孢子接种量与蜜蜂的发病率密切相关(r=0.9883),蜜蜂幼虫对低于1.0×103孢子/mL的侵染有抗性,与不接孢子的对照组差异不显著(P>0.05)。蜜蜂不同龄期接种发病率的差异是因不同龄幼虫食量不同导致的摄入孢子剂量的不同引起的,28℃低温处理能够显著提高处于幼虫到蛹转化期蜜蜂的发病率(P<0.05),而对取食阶段的蜜蜂幼虫没有影响。病理学研究表明,在整个幼虫期,摄入的孢子因中肠没有氧气不生长,对幼虫没有致病性,幼虫的取食和发育过程正常,至幼虫期结束进入蛹期后,蜜蜂的中后肠接通,摄入的孢子伴随蜜蜂的蛹便进入后肠并在此迅速萌发生长,在1～2d内菌丝即突破体表,导致蜜蜂死亡。蜜蜂球囊菌选择营养物质储存最多而防御能力较低的幼虫到蛹转化期侵染,降低了侵染成本,提高成功率。该研究阐明了蜜蜂球囊菌侵染蜜蜂的机制,丰富了昆虫与病原菌之间相互作用的内容。

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌早期胁迫的转录组学

【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前,尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康(Ac CK)及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道(Ac T)进行深度测序,在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina Hi Seq 2500平台对Ac CK和Ac T进行双端(PE125)测序,首先对测序数据进行质控和评估,利用edge R软件进行差异表达基因(DEG)分析,进而对DEGs进行GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析,最后,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Ac CK和Ac T的转录组测序共得到188 457 338条原始读段(raw reads),经过滤得到182 088 448条有效读段(clean reads),两端Q20与Q30均在97.96%和94.97%以上,说明测序数据质量良好;主成分分析(PCA)结果显示第一与第二主成分可分别解释基因表达总体差异的75.8%和10.7%;DEG分析结果显示上调基因与下调基因的数量分别为344和239个;GO富集分析结果显示DEGs共富集在36个GO分类(term)上,其中基因富集数最多的细胞(106 unigenes)、细胞组件(106 unigenes)和代谢进程(104 unigenes);KEGG代谢通路富集分析结果显示上调与下调基因分别富集在72个和45个代谢通路上,其中上调基因富集数最多的是核糖体(72 unigenes)、碳代谢(16 unigenes)和糖酵解(14 unigenes),而下调基因富集数最多的是碳代谢(9 unigenes)、二羧酸代谢(8 unigenes)和氨基酸生物合成(7 unigenes),进一步分析表明中蜂幼虫肠道的部分细胞免疫对球囊菌的胁迫产生应答,而体液免疫不产生应答,宿主的代谢相关基因受到球囊菌的显著抑制。【结论】揭示了中蜂幼虫在球囊菌入侵早期的胁迫应答,为深入解析中蜂幼虫的胁迫应答机制提供了重要信息,也为在分子水平研究关键应答基因打下了基础。

意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达微小RNA及其靶基因分析

【目的】蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis(简称球囊菌)是一种特异性侵染蜜蜂幼虫肠道的致死性真菌病原。微小RNA(microRNA,mi RNA)是一种在转录后水平对m RNA进行负调控的关键调控因子。本研究旨在对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达mi RNAs(DEmiRNAs)及其靶基因进行深入分析,为揭示DEmiRNAs在胁迫应答中的作用提供重要信息。【方法】利用small RNA-seq(s RNA-seq)技术对正常及球囊菌侵染的意蜂6日龄幼虫肠道(分别表示为Am CK和Am T)进行测序,通过相关生物信息学软件对DEmiRNAs进行预测和分析。利用TargetFinder软件预测DEmiRNAs的靶基因,然后利用Blast软件对靶基因进行GO和KEGG数据库的功能注释。通过Cytoscape软件构建DEmiRNAs与其靶m RNAs的调控网络。通过茎环实时荧光定量PCR(stem-loop RT-qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Am CK和Am T的测序分别得到9 230 496和10 823 667条有效序列标签; Am CK vs Am T比较组中包含15个上调和6个下调mi RNAs,分别结合3 503和3 252个靶基因,它们可分别注释到40和39个GO terms以及104和99条代谢通路;进一步分析发现调控网络中的17个DEmiRNAs靶向结合116个与丝氨酸蛋白酶相关的m RNAs,14个DEmiRNAs靶向结合54个与泛素介导的蛋白水解相关的m RNAs。Stem-loop RT-qPCR验证结果显示随机选择的4个DEmiRNAs (mi R-251-x,mi R-9277-y,mi R-1672-x和mi R-4968-y)的表达量变化趋势与测序结果一致,表明测序数据真实可信。【结论】本研究率先对意蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的DEmiRNAs及其靶基因进行预测与分析,提供了mi RNAs的表达谱和差异表达信息。ame-miR-927b,mi R-429-y和mi R-8440-y等DEmiRNAs可能参与对丝氨酸蛋白酶的调控和对泛素介导的蛋白水解的调控,DEmiRNAs与靶基因之间存在复杂的调控网络关系。DEmiRNAs可参与到意蜂幼虫肠道与球囊菌间的互作。

温度、相对湿度和pH对蜜蜂球囊菌孢子萌发的影响

研究了温度、相对湿度和 pH对蜜蜂球囊菌 (Ascosphaeraapis)孢子萌发 3个阶段 (活化、膨大、产生萌发管 )的影响 .结果表明 ,孢子活化和膨大在 15～ 40和 (2 5～ 40 )± 0 5℃范围内受温度的影响不明显 (P >0 0 5 ) ;萌发管仅发生在 2 5～ 37± 0 5℃ ,最适温度位于 (31～ 35 )± 0 5℃ .相对湿度越大 ,越有利于孢子萌发 ,而相对湿度低于 80 %对孢子萌发极为不利 .孢子萌发的 3个阶段在 pH为 5～ 7 8时几乎不受 pH变化的影响 ,而在 pH值较低影响很大 .可见 ,A .apis是一种高度专一的蜜蜂幼虫病原体 .

蜜蜂球囊菌分泌多种胞外酶侵染蜜蜂幼虫

对健康和患病蜜蜂幼虫血淋巴进行SDS-PAGE电泳和蛋白酶、酯酶的活性染色,以研究蜜蜂球囊菌分泌的胞外酶种类及对蜜蜂侵染的作用.结果表明:健康蜜蜂幼虫血淋巴中的蛋白含量丰富,主要由4种高分子质量的蛋白组成,而患病幼虫血淋巴中的蛋白含量很少,主要蛋白组分被降解;在患病幼虫血淋巴中可以检测到健康幼虫所没有的多种蛋白酶和酯酶的活性.可见,蜜蜂球囊菌在侵染蜜蜂幼虫的过程中涉及到胞外酶的作用,这些胞外酶参与降解蜜蜂的组织,为蜜蜂球囊菌的生长提供营养.

营养生态条件对蜜蜂球囊菌生长及产孢的影响

从碳源、氮源、维生素、矿质元素等方面研究了营养生态条件对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis Olive＆Spiltoir)生长及产孢的影响。结果表明,营养生态条件的变化对蜜蜂球囊菌的影响极大。A.apis菌丝体生长最好的碳源是果糖,产孢量最高的是葡萄糖,不利用山梨糖和甘露糖;该菌优先利用有机氮源,不利用无机氮源中NaNO_2、H_2NCSNH_2;维生素对A.apis产孢量有极为显著的影响,复合维生素比单一维生素能更好地促进菌丝体生长,尤其对产孢更为有利;矿质元素中Mg^(2+)、P^(5+)、K^+、Zn^(2+)促进菌丝体生长和孢子的形成,Na^+对菌丝体的生长有抑制作用。

蜜蜂患白垩病虫体内一株球囊菌拮抗细菌的分离与鉴定

【目的】寻找抑制蜜蜂球囊菌的拮抗菌,用于白垩病的生物防治。【方法】利用细菌纯化技术从患白垩病的蜜蜂幼虫体内分离纯化了一株对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)有抑制作用的细菌,并结合形态学、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析技术进行鉴定,同时通过蜜蜂体内、体外接种试验研究其对蜜蜂球囊菌的抑制作用。【结果】该细菌被初步鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),它在培养基中能够完全抑制蜜蜂球囊菌的生长,但其发酵液对蜜蜂球囊菌的生长没有影响。将含菌饲料喂蜜蜂幼虫,蜜蜂幼虫的死亡率和生长发育没有受到影响,说明该细菌对蜜蜂幼虫没有致病性。蜜蜂幼虫体内同时接种细菌和球囊菌孢子,发现细菌对球囊菌在蜜蜂体内的萌发和初期菌丝的生长没有影响,蜜蜂依然能够患病,但生长后期该细菌能够降解球囊菌菌丝,对球囊菌子代孢子的产生表现出一定的抑制作用。【结论】该研究结果为蜜蜂白垩病的生物防治提供了理论依据。

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的可变剪切基因分析

基于前期已获得的中华蜜蜂(简称中蜂)幼虫肠道转录组数据,利用TopHat2软件在正常(AcCK)及球囊菌胁迫的中蜂幼虫肠道样品(AcT1、AcT2、AcT3)中共鉴定出发生于9124个基因的57327个可变剪切事件,其中以基因间(17.68%)、可变3′端剪切(15.32%)、外显子跨越(14.12%)和可变5′端剪切(12.81%)类型为主.Venn分析结果显示4个肠道样品的共有可变剪切基因数为8111个,特有可变剪切基因数分别为272、189和385个.GO分类结果显示共有可变剪切基因涉及47个条目,AcT1、AcT2、AcT3的特有可变剪切基因分别富集于24、20和34个条目.KEGG代谢通路富集分析结果显示,共有可变剪切基因富集在327个代谢通路,基因富集数最多的是RNA转运、内质网蛋白加工及核糖体;AcT1、AcT2、AcT3的特有可变剪切基因分别富集在22、46和83个代谢通路.结果揭示了可变剪切基因在宿主的胁迫响应过程中的重要作用.

中华蜜蜂6日龄幼虫肠道响应球囊菌胁迫的差异表达基因分析

蜜蜂球囊菌特异性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病,严重危害养蜂生产。本研究利用RNA-seq技术对健康及球囊菌胁迫的中蜂幼虫肠道进行深度测序,进而对宿主的差异表达基因进行深入分析。本研究中,幼虫肠道样品的RNA-seq共得到191167730条原始读段(raw reads),经过滤得到186284296条有效读段(clean reads),差异表达基因(DEG)分析结果显示上调与下调基因的数量分别为4513和385个。Gene ontology(GO)富集分析结果显示,上调基因富集在45个GO条目(term),富集基因数最多的是细胞进程、代谢进程及催化活性,下调基因富集在32个GO term,富集基因数最多的是代谢进程、单组织进程及催化活性,KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果显示上调基因富集在193个pathway,其中富集基因数最多的是核糖体、氨基酸的合成、碳代谢。下调基因富集在59个pathway,其中富集基因数最多的是甘氨酸、碳代谢以及二羧酸代谢。深入分析发现宿主的细胞免疫被显著激活,体液免疫中的Toll-like与Jak-STAT信号通路也被球囊菌所激活。研究结果为揭示中蜂幼虫在球囊菌入侵后期的胁迫应答机制提供了重要的信息,也为解析中蜂幼虫的球囊菌抗性机制奠定了基础。

意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道内球囊菌的差异表达基因分析

为检测蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)在胁迫意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫后期的基因表达谱,利用RNA-seq技术对纯培养的球囊菌孢子及球囊菌胁迫的意蜂6日龄幼虫肠道进行深度测序。通过比较处理组和对照组得到21 361个差异表达基因(DEGs),包括15 306个上调基因和6 055个下调基因。GO富集分析结果显示,上调基因富集于39个GO条目(term),基因富集数最多的为细胞进程(2 416unigenes)、细胞(2 408 unigenes)和细胞组件(2 408 unigenes);下调基因富集于38个GO term,基因富集数最多的为代谢进程(1 227 unigenes)、细胞进程(1 185 unigenes)和细胞(1 131 unigenes)。KEGG代谢通路富集分析结果显示,上调基因富集在119个通路,其中基因富集数最多的是核糖体(221 unigenes),其次为内质网中蛋白加工(190 unigenes)和内吞作用(177 unigenes);下调基因富集在113个通路上,基因富集数最多的是核糖体(144 unigenes),其次为RNA转运(113 unigenes)和氨基酸生物合成(108 unigenes)。进一步分析发现,富集在MAPK信号通路上的64个基因上调表达,说明该通路在球囊菌胁迫后期被激活。研究结果不仅为揭示球囊菌在胁迫意蜂幼虫后期的病原-宿主互作提供了重要信息,也为阐明球囊菌致病的分子机制奠定了基础。

环介导等温扩增(LAMP)技术检测蜜蜂球囊菌

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。[方法]根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3(5'-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3')、A.apis-B3(5'-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3')、A.apis-FIP(5'-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3')和A.apis-BIP(5'-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3'),进行LAMP扩增试验,分别设置Mg^(2+)终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^(-1),dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^(-1),内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^(-1),甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mo1·L-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)、蜜蜂残翅病毒(Deformed wing virus,DWV)、蜜蜂囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)和以色列急性麻痹病毒(Israel acute paralysis virus,IAPV)基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^(-1)、0.2231×10^(-2)、0.2231×10^(-3)、0.2231×10^(-4)、02231×10^(-5)、0.2231×10^(-6)、0.2231×10^(-7)、0.2231×10^(-8)μg·μL^(-1)作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^(-1)Mg^(2+)、1.2 mmol·L^(-1)dNTPs、1.6 mmol·L^(-1)FIP/BIP、0.4 mol·L^(-1)甜菜碱,并在63℃反应60 min可完成检测。选用蜜蜂球囊菌、东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒的基因组作为LAMP反应模板进行特异性检测,结果显示仅有蜜蜂球囊菌有扩增曲线和梯状条带,建立的LAMP检测体系有很好的特异性。将蜜蜂球囊菌基因组DNA浓度0.2231、0.2231×10^(-1)、0.2231×10^(-2)、0.2231×10^(-3)、0.2231×10^(-4)、0.2231×10^(-5)μg·μL^(-1)作为模板进行PCR反应后,检测结果为阳性,随DNA浓度降低,电泳检测不能观察到PCR的扩增产物。进行LAMP反应时,浊度曲线和电泳条带显示可检测DNA浓度为0.2231×10^(-6)μg·μL^(-1)。LAMP每反应检出量比PCR高10倍,并且方法简单、节省时间。【结论】成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测蜜蜂球囊菌技术,为相关研究和应用提供了技术支持。

蜜蜂球囊菌荧光PCR快速检测方法的建立及应用

以蜜蜂球囊菌ITS1、ITS2和5.8 S rDNA保守序列(U68313)为参考,设计一对特异性引物和一条TaqMan探针,建立了一种快速检测蜜蜂球囊菌的荧光PCR方法。该方法灵敏度达1 ng/μL的阳性DNA比常规PCR高10倍。检测的特异性高,与蜜蜂幼虫芽胞杆菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂败血杆菌无交叉反应,同时可避免常规PCR因电泳造成的污染。应用该方法对蜜蜂及蜂制品的实际样品和模拟样品进行检测,结果显示所建立的荧光PCR检测方法在4 h内即可报告结果,与传统病原菌分离培养、常规PCR相比较,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点,可以用于蜜蜂及其制品中蜜蜂球囊菌的快速检测和进出境检疫。

胁迫中华蜜蜂幼虫肠道的球囊菌及其体外培养的高表达基因分析

利用RNA-seq技术对胁迫中华蜜蜂(简称中蜂)6日龄幼虫肠道的球囊菌及其体外培养进行深度测序,根据基因的FPKM值筛选得到高表达基因(HEGs),进而对HEGs进行GO及KEGG代谢通路(pathway)富集分析.Illumina测序数据经质控和过滤得到100814558条有效读段(clean reads),平均Q30均在93.81%以上.GO富集分析结果显示处理组(Aac T)的HEGs富集于39个GO term,基因富集数最多的是细胞(1872 unigene)、细胞组件(1872 unigene)和细胞进程(1748 unigenes);对照组(Aa CK)的HEGs富集于37个GO term,基因富集数最多的是细胞(785 unigenes),其次是细胞组件(785 unigenes)和代谢进程(776 unigenes).KEGG pathway富集分析显示,Aac T的HEGs富集在119个代谢通路上,基因富集数最多的是核糖体(176 unigenes)、碳代谢(147 unigenes)及氨基酸的生物合成(134 unigenes);Aa CK的HEGs富集在110个代谢通路上,基因富集数最多的是核糖体(179 unigenes)、氨基酸的生物合成(70 unigenes)以及碳代谢(62 unigenes).深入分析发现,对于富集在MAPK信号通路上的高表达基因数量,胁迫中蜂幼虫肠道的球囊菌远多于体外培养的球囊菌,说明病原的该通路在胁迫后期被显著激活.

意大利蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的可变剪接基因分析

为探讨可变剪接基因在宿主响应球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫过程中的作用,基于前期已获得的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)幼虫肠道转录组数据进行可变剪接基因分析。在正常的意蜂4日龄幼虫肠道(AmCK),球囊菌胁迫的意蜂4、5和6日龄幼虫肠道(AmT1、AmT2、AmT3)中共鉴定出55 895个可变剪接事件,以外显子跨越和可变3′端剪接为主。各样品的共有可变剪接基因数为8 157个,AmT1、AmT2、AmT3的特有可变剪接基因数分别为207、334和542个。GO分类结果显示共有可变剪接基因分布在50个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,共有可变剪接基因富集在290个pathway,基因富集数最多的是内质网蛋白加工、RNA运输和碳代谢。上述分析结果揭示了可变剪接基因在意蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫过程中的重要作用,为深入研究可变剪接基因的功能打下了基础。

不同辐照剂量对蜂球囊菌杀灭效果的影响

本试验以蜂球囊菌(Ascosphaera apis)为研究对象,探究不同辐照剂量对蜂球囊菌的杀灭效果,以期明确有效杀灭蜂球囊菌的最低辐照剂量,为Co60γ射线辐照蜜蜂饲料(特别是蜂花粉)时的辐照剂量选择提供依据。利用细菌纯化技术从患白垩病意蜂幼虫体内分离纯化得到蜂球囊菌,并结合形态学、乳酸酚棉兰染色及5.8SrDNA序列分析技术进行鉴定;同时制备不同梯度浓度的蜂球囊菌孢子悬液加入到蜜蜂幼虫饲料中,以饲喂方式侵染3日龄意蜂幼虫,确定半数致死浓度(LC50);蜜蜂幼虫饲料中添加上述确定LC50的孢子,以不同辐照剂量处理,并通过侵染幼虫试验,确定有效杀灭蜜蜂饲料中孢子的最低辐照剂量。结果表明,通过形态学和分子生物学鉴定,从患白垩病的意蜂幼虫体内分离纯化得到真菌即为蜜蜂白垩病的病原——蜂球囊菌;蜂球囊菌对人工饲养条件下的意蜂幼虫的LC50为9.5×104个/mL;当Co60γ射线辐照剂量为7.0kGy时,幼虫患病率与未辐照组差异显著(P<0.05),由此确定对添加半数致死浓度的蜂球囊菌孢子饲料的最低有效辐照剂量为7.0kGy。

蜜蜂对接种球囊菌孢子幼虫清除行为的研究

为研究不同白垩病抗性蜜蜂蜂群对接种蜜蜂球囊菌孢子幼虫的清除行为。利用微量移液器对未患白垩病的意大利蜜蜂、患白垩病的意大利蜜蜂以及从未报道患病的中华蜜蜂的二日龄幼虫接种蜜蜂球囊菌孢子的水溶液,观察计算患病与否蜂群对接种幼虫的清除能力的差异。结果显示,未患病的意大利蜜蜂和中华蜜蜂对接种蜜蜂幼虫分别有65%和60%的清除率,而患病意大利蜜蜂则只有约22%的清除率。抗性蜂群对接种幼虫的清除主要发生在接种后的2～3天内和化蛹后,而患病蜂群在幼虫期则基本没有清除,只在蛹期有少量的清除。该结果说明,对染病幼虫的及时清除行为是蜜蜂抗白垩病的重要机制。

大蒜素对蜜蜂球囊菌的抑菌和杀菌活性研究

本研究旨在探明大蒜素对蜜蜂白垩病的病原菌蜜蜂球囊菌在体外的抑菌和杀菌活性。试验以蜜蜂球囊菌为受试菌,采用琼脂倍比稀释法测定最小抑菌浓度(MIC),采用琼脂培养基法测定最小杀菌浓度(MBC),测试大蒜素对蜜蜂球囊菌的体外抑菌和杀菌活性。结果表明,大蒜素对蜜蜂球囊菌的MIC为12.0mg/mL,MBC为24.0mg/mL。证实大蒜素在体外对蜜蜂球囊菌具有较好的抑菌和杀菌作用。

丁香等11种中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)的抑制作用研究

蜜蜂白垩病是当前养蜂生产上危害严重的一种真菌传染病,为探寻安全控制蜜蜂白垩病的方法,本研究制备了1 1种中药的水浸提液,并配置了3种不同稀释度的含药培养基,研究蜜蜂球囊菌在不同含药培养基中的生长情况。结果表明:(1)配置稀释度为10^(-1)的中草药水浸提液和对照组比,对蜜蜂球囊菌均没有显著的抑制作用(P>0.05)。(2)配置稀释度为3×10^(-1)的中草药水浸提液和对照组比,丁香、黄柏两种中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌具有极显著的抑制作用(P<0.01),而其他的中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌均没有显著的抑制作用(P>0.05)。(3)配置较稀释度为6×10^(-1)的中草药水浸提液和对照组比:红花、茵陈、百部、陈皮四种中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌均没有显著的抑制作用(P>0.05);苦参、防己、女贞子、五味子、桃仁五种中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌均有显著的抑制作用(P<0.05);丁香、黄柏两种中草药水浸提液对蜜蜂球囊菌具有极显著的抑制作用(P<0.01),该结果为利用中草药治疗蜜蜂白垩病提供了理论依据。