理冲生髓饮有效组分调控相关信号通路对卵巢癌自噬的影响研究

目的观察理冲生髓饮有效组分(LCSSY)调控腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶-失调51样激酶1(ULK1)信号通路对卵巢癌自噬的影响。方法体外培养卵巢癌SKOV3细胞,制备LCSSY含药血清,采用随机数字表法将SD大鼠分为空白对照组和LCSSY低、中、高剂量组。细胞计数盒8法检测卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制率;蛋白质印迹法检测计算自噬相关蛋白重组人自噬效应蛋白(Beclin-1)、人微管相关蛋白轻链3Ⅱ与小鼠微管相关蛋白轻链3Ⅰ比值(LC3Ⅱ/Ⅰ)、自噬接头蛋白(P62)以及AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白的表达,并采用AMPK激活剂验证其作用机制。结果给药24、48 h,LCSSY低、中、高剂量组对SKOV3细胞增殖的抑制率均大于空白对照组,且随着药物浓度的增加抑制程度逐渐加强(均P<0.05);另外,给药48 h LCSSY低剂量组、LCSSY中剂量组抑制率均大于本组给药24 h时(均P<0.05)。与空白对照组比较,LCSSY低、中、高剂量组均能够下调Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达,上调P62的表达,且呈剂量依赖性[(0.98±0.02)、(0.59±0.02)、(0.55±0.02)比(1.46±0.12),(4.45±0.21)、(4.00±0.25)、(2.95±0.21)比(5.98±0.23),(0.67±0.02)、(0.94±0.05)、(1.53±0.13)比(0.30±0.02)](均P<0.05)。与空白对照组比较,LCSSY低、中、高剂量组均可以降低AMPK和ULK1表达,升高mTOR复合物1表达,且呈剂量依赖性(均P<0.05)。AMPK激活剂逆转AMPK/mTOR/ULK1信号通路后,与单独LCSSY高剂量组相比,LCSSY高剂量联合AMPK激活剂组使AMPK、ULK1蛋白表达量升高,而mTOR复合物1蛋白表达量降低(均P<0.05)。结论LCSSY可能通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路抑制卵巢癌细胞自噬。

理冲生髓饮对Fischer344大鼠卵巢肿瘤组织的抑瘤作用及对VEGF表达的影响

目的观察理冲生髓饮对大鼠卵巢肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法采用二甲基苯蒽(DMBA)卵巢局部埋线法诱发大鼠卵巢肿瘤模型,检测理冲生髓饮对卵巢肿瘤的抑瘤率,通过免疫组化SABC法检测肿瘤组织VEGF的表达情况。结果理冲生髓饮对卵巢肿瘤组织有抑制作用,其抑瘤率与桂枝茯苓丸组比较,差异有统计学意义(P<0.01);同时能够明显地降低卵巢瘤细胞中VEGF基因蛋白的表达水平,与模型组和桂枝茯苓丸组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论中药复方理冲生髓饮对卵巢恶性肿瘤组织中VEGF基因蛋白的过度表达有调节作用。

理冲生髓饮对卵巢上皮性癌患者免疫状态影响的临床研究

目的 :研究理冲生髓饮提高卵巢癌患者免疫功能的机理。方法 :随机设单纯化疗组和理冲生髓饮加化疗组针对NK细胞活性、T淋巴细胞亚群、红细胞C3 b受体等指标进行临床研究。结果 :理冲生髓饮可以减轻化疗药物的毒副作用 ,保障化疗顺利进行 ,同时通过增强卵巢患者免疫功能而达到抗肿瘤的作用。结论 :理冲生髓饮对卵巢癌具有减毒增效、抗肿瘤的作用。

HPLC-DAD法同时测定理冲生髓饮中7种亲脂性成分

目的建立RP-HPLC法同时测定理冲生髓饮中亲脂性成分的分析方法。方法理冲生髓饮超临界萃取,HPLC法分析采用Dikma Diamonsil-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,以0.1%磷酸水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱,体积流量为1 m L/min,检测波长210 nm。结果姜黄素、莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、亚油酸、β-榄香烯分别在0.16-8.14μg/m L、0.27-13.44μg/m L、0.10-4.98μg/m L、0.18-9.10μg/m L、0.08-4.06μg/m L、0.21-10.59μg/m L、0.28-14.18μg/m L范围内线性关系良好。平均加样回收率在96.76%-100.38%之间。结论本方法能够准确测定理冲生髓饮7种亲脂性成分。

理冲生髓饮对卵巢癌SKOV3细胞周期和凋亡影响

目的:探讨理冲生髓饮对卵巢癌SKOV3细胞周期和凋亡影响。方法:以卵巢癌SKOV3细胞为研究对象,采用CCK-8法检测不同浓度顺铂对SKOV3细胞抑制作用,AnnexinV-FITC法检测SKOV3细胞凋亡情况,细胞周期与细胞凋亡检测试剂测定SKOV3细胞周期变化,流式细胞术检测SKOV3细胞中CD44^+CD117^+细胞比例。结果:与空白组比较,24h和48h顺铂组SKOV3细胞凋亡率明显增加,G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高,CD44^+CD117^+细胞比例明显增加,与顺铂组比较,24h和48h理冲生髓饮联合顺铂组SKOV3细胞凋亡率明显增加,G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高,CD44^+CD117^+细胞比例明显降低,其中理冲生髓饮中剂量组联合顺铂组作用效果最强。结论:理冲生髓饮具有抗肿瘤作用,其机制可能是增加顺铂对卵巢癌SKOV3细胞凋亡,调控细胞周期阻滞,降低卵巢癌SKOV3细胞中干细胞数量。

复方理冲生髓饮对二甲基苯蒽诱发的大鼠卵巢肿瘤组织形态学的影响

目的:观察中药复方理冲生髓饮对二甲基苯蒽诱发大鼠卵巢肿瘤组织形态学的变化。方法:采用苯溶二甲基苯蒽(DMBA)卵巢局部埋线法诱发大鼠卵巢肿瘤模型,观察理冲生髓饮对模型大鼠卵巢肿瘤组织光镜和电镜下病理形态学及超微结构的变化。结果:理冲生髓饮对诱发的卵巢肿瘤组织形态改变明显,光镜下细胞病理改变以卵巢实质增生和腺泡囊肿为主,细胞异型性不大,间质受浸较轻。电镜下细胞核固缩,染色体边集,胞浆内可见大量脂滴堆积,出现凋亡小体。结论:理冲生髓饮对化学致癌因子诱发的大鼠卵巢肿瘤有抑制和阻断作用,并且长期用药在抑制靶细胞的肿瘤性转归方面具有显著效果。

理冲生髓饮药物血清对卵巢癌细胞集落形成和Bcl-2蛋白表达的影响

目的:探讨中药复方理冲生髓饮药物血清对人卵巢癌细胞株SKOV3集落形成和对Bcl-2蛋白表达的作用机理。方法:以不同剂量理冲生髓饮水煎剂灌饲大鼠,制备药物血清,培养SKOV3卵巢癌细胞株,采用SABC法检测SKOV3细胞Bcl-2蛋白表达和显微镜观察集落形成情况。结果:理冲生髓饮血清组Bcl-2基因蛋白表达低于顺铂组和空白血清组(P<0.01);显微镜下可见集落内SKOV3细胞数量少,结构松散。结论:理冲生髓饮药物血清对人卵巢癌细胞SKOV3的体外生长有抑制作用,可阻断Bcl-2癌基因蛋白的表达,提示Bcl-2是一种重要的细胞生存基因。

理冲生髓饮有效组分调控炎性因子对卵巢癌侵袭转移影响的研究

目的探究理冲生髓饮有效组分通过调控炎性因子对卵巢癌SKOV3细胞侵袭转移的影响。方法①将32只大鼠随机分为空白组、生髓饮低剂量组、生髓饮中剂量组和生髓饮高剂量组,每组8只。生髓饮低、中、高剂量组分别给予3.76 g/(kg·d)、7.52 g/(kg·d)、11.28 g/(kg·d)理冲生髓饮灌胃,空白组给予同体积蒸馏水灌胃,均2次/d,连续7 d。末次灌胃结束2 h后眼眶取血,获得含药血清。②实验分为空白组、生髓饮低剂量含药血清组、生髓饮中剂量含药血清组、生髓饮高剂量含药血清组和贝伐单抗组,应用鸡胚绒毛尿囊膜血管实验观察各组血管生成情况。③选取在体外培养至对数生长期的人卵巢癌SKOV3细胞,分为空白组、生髓饮低剂量含药血清组、生髓饮中剂量含药血清组、生髓饮高剂量含药血清组和贝伐单抗组,除空白组外,其余组分别加入相应浓度的理冲生髓饮含药血清及5 mg/L贝伐单抗培养,应用MTT法观察各组细胞增殖情况,用Transwell小室实验以及划痕实验检测细胞的迁移和侵袭能力,应用ELISA法检测卵巢癌相关炎性因子蛋白表达水平。结果生髓饮各含药血清组及贝伐单抗组一级和二级血管数目均明显少于空白组(P均<0.05),且生髓饮中剂量含药血清组和贝伐单抗组均明显少于生髓饮低、高剂量含药血清组(P均<0.05);与空白组比较,生髓饮各含药血清组及贝伐单抗组SKOV3细胞迁移率和侵袭率均显著降低(P均<0.05),且生髓饮中、高剂量含药血清组和贝伐单抗组均显著低于生髓饮低剂量含药血清组(P均<0.05)。生髓饮各含药血清组及贝伐单抗组血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及生髓饮高剂量含药血清组、贝伐单抗组白细胞介素-1(IL-1)水平均明显低于空白组(P均<0.05);生髓饮高剂量含药血清组和贝伐单抗组VEGF、IL-6、TNF-α水平均明显低于生髓饮中、低剂量含药血清组(P均<0.05),各组基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论理冲生髓饮有效组分能够抑制卵巢癌SKOV3细胞的侵袭转移,其作用机制与抑制相关炎性因子的表达、影响肿瘤周围的炎性微环境有关。

理冲生髓饮有效组分对卵巢癌组织的相关基因表达与血管生成影响

目的:应用基因芯片技术对理冲生髓饮作用后人卵巢癌基因表达谱进行分析并且筛选差异表达基因,从信号转导方面和血管生成方面探讨中药复方理冲生髓饮对人卵巢癌作用机制。方法:建立Balb/C裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型,随机分为模型组和中药中剂量组。停药后将肿瘤组织分离。并且采用基因芯片技术,研究其表达图谱,从中筛选出中药中剂量组与模型组差异基因表达,探讨中药可能作用机制。结果:在分析差异基因的表达时,探索中药复方理冲生髓饮作用后,可能改变的信号通路有Jak-STAT信号通路、TNF信号通路、Nf-κb信号、HIF-1信号通路、趋化因子信号通路以及t细胞受体信号通路和胰岛素信号通路,BAG信号通路等。结论:基因芯片分析与卵巢癌相关差异基因12条;差异表达基因可能与肿瘤血管生成相关。

多指标正交试验优化理冲生髓饮的醇提工艺

目的优选理冲生髓饮的最佳醇提工艺。方法采用L_9(3~4)正交试验法,以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷的转移率和干膏得率为指标,通过综合评分法,考察乙醇浓度、提取时间、提取温度、溶媒用量对理冲生髓饮醇提工艺的影响。结果最佳提取工艺为:10倍量60%乙醇浸泡2 h后,加热回流提取2次,提取时间1.5 h,提取温度80℃。结论该工艺提取率高,工艺稳定、可行,可为理冲生髓饮的进一步研究提供数据。

理冲生髓饮中多糖及水溶性蛋白质的质量分数测定

建立理冲生髓饮中多糖及水溶性蛋白质质量分数测定的方法.测定理冲生髓饮多糖对葡萄糖的换算因子,利用苯酚-硫酸法测定多糖的质量分数;采用考马斯亮蓝G-250染色法测定理冲生髓饮中可溶性蛋白质的质量分数.多糖标准曲线方程为A=12.839 C-0.008 5（r=0.999 3）,蛋白质标准曲线方程为A=1.271 C-0.033 1（r=0.999 2）,两者分别在0.01～0.1、0.1～1.0 g/L有良好的线性关系.测得理冲生髓饮中多糖质量分数为8.53%,水溶性蛋白质质量分数为0.35%.该两种方法操作简便、灵敏、快速、准确,重复性好,可用于理冲生髓饮中多糖、水溶性蛋白质的质量分数测定.

理冲生髓饮对大鼠卵巢肿瘤组织P^(53)和PCNA表达影响的研究

目的:观察理冲生髓饮对大鼠卵巢肿瘤组织P53和PCNA表达的影响。方法:采用二甲基苯蒽(DMBA)卵巢局部埋线法诱发大鼠卵巢肿瘤模型,观察理冲生髓饮对癌组织P53和PCNA表达的影响,免疫组化SABC法检测卵巢肿瘤组织的P53和PCNA阳性表达。结果:大鼠卵巢肿瘤组织存在P53蛋白基因和PC-NA的过度表达。理冲生髓饮组可降低卵巢肿瘤细胞的PCNA和P53的表达,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。结论:P53基因蛋白的突变可能是导致大鼠卵巢恶性肿瘤发生发展的原因,理冲生髓饮对其过度表达有调节作用。

理冲生髓饮对卵巢癌细胞株SKOV3基因表达的影响

目的:研究理冲生髓饮对人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3的抑制作用,并利用基因表达谱芯片探索其作用机制。方法:Wistar大鼠随机分组,灌胃给药,采血制备含药血清。提取对照组及理冲生髓饮组肿瘤细胞mRNA,制备cDNA探针并分别用Cy3和Cy5两种荧光染料标记,与基因表达谱芯片进行杂交,经扫描、分析,得出药物作用后表达有差异的基因。结果:共筛选出显著表达差异基因136种,其中16种基因表达水平下调,120种基因表达上调。结论:理冲生髓饮对SKOV3生长有抑制作用,调节癌基因及其相关的信号传导、改变肿瘤细胞蛋白合成等可能是其作用机制。

理冲生髓饮有效组分对卵巢癌干细胞调控相关基因及顺铂耐药性的影响及其作用机制研究

背景本课题组前期对理冲生髓饮有效组分进行了抗卵巢癌的研究,结果表明中药复方可以抑制卵巢癌细胞增殖,诱导癌细胞凋亡,减少癌细胞黏附,抑制血管新生,由此提出理冲生髓饮有效组分可以逆转卵巢癌干细胞耐药这一假说。目的探讨理冲生髓饮有效组分对卵巢癌干细胞调控相关基因及顺铂耐药性影响及其作用机制。方法2017年10月—2018年4月,选取BALB/C裸鼠48只,构建卵巢癌SKOV3荷瘤鼠模型,将裸鼠分为空白组(给予0.9%氯化钠溶液,12只)、顺铂组(给予顺铂,12只)、中药组(给予理冲生髓饮有效组分混合物,12只)、中药+顺铂组(除给予理冲生髓饮有效组分混合物外同时给予顺铂,12只)。于造模第8天开始给药,共给药18 d。最终空白组死亡4只裸鼠,顺铂组死亡3只裸鼠,中药组死亡1只裸鼠,中药+顺铂组死亡1只裸鼠。绘制各组肿瘤生长曲线。给药结束后处死裸鼠,制备肿瘤组织,HE染色观察肿瘤病理学特征,免疫荧光染色观察肿瘤CD^+_(44)、CD^+_(117)、CD_(44)、CD_(117)、CD_(133)细胞情况,PCR检测肿瘤Nanog、Oct4、ABCC1 mRNA表达水平,免疫组化法检测肿瘤Nanog、Oct4、ABCC1表达水平。结果各组在给药第1～7天肿瘤生长速度均逐渐增快;在给药第7～10天中药组和中药+顺铂组肿瘤生长速度明显变慢,而空白组和顺铂组肿瘤生长速度较快;中药组和中药+顺铂组肿瘤在第13天生长体积达到高峰,之后逐渐下降,而空白组和顺铂组肿瘤生长速度仍逐渐增快。顺铂组肿瘤细胞数目明显减少,体积缩小,核分裂象可见,可见大量肿瘤细胞凋亡,间质纤维组织明显增生;中药组肿瘤细胞数目减少,肿瘤组织呈较明显的片状坏死,间质中纤维组织和纤维细胞增生;中药+顺铂组肿瘤细胞数目明显减少,可见大量肿瘤细胞凋亡,间质纤维组织明显增生。肿瘤中可见少量CD^+_(44)、CD^+_(117)、CD_(133)、CD_(44)、CD_(117)细胞。顺铂组、中药组、中药+顺铂组肿瘤Nanog、Oct4 m RNA表达水平高于空白组(P<0.05);中药组肿瘤Nanog mRNA表达水平高于顺铂组、中药+顺铂组(P<0.05);中药+顺铂组肿瘤ABCC1 mRNA表达水平低于空白组、顺铂组、中药组(P<0.05)。顺铂组、中药+顺铂组肿瘤Nanog表达水平低于空白组(P<0.05);中药组肿瘤Oct4表达水平低于空白组、顺铂组(P<0.05);中药组、中药+顺铂组肿瘤ABCC1表达水平低于空白组、顺铂组(P<0.05)。结论理冲生髓饮有效组分可通过下调ABCC1及其m RNA表达水平,增高肿瘤细胞中药物浓度,还可通过影响卵巢癌干细胞特性和顺铂敏感性,从而逆转卵巢癌对顺铂的耐药性。

从络病理论探讨卵巢癌的病机及理冲生髓饮治疗思路

络病理论是目前发现能有效解决疑难疾病的一种新的理论。文章从络病理论出发,结合妇科"胞络"的特点,提出痰瘀癌毒郁积是卵巢癌发病的根本。理冲生髓饮正是基于络病理论提出卵巢癌的治疗当以抗癌解毒、化瘀通络、扶正培本为基本治则,并指出肿瘤血管生成是一种病理机制,归属"病络",中医"络"的概念在形态和功能上与西医学的微血管与微循环概念相似。理冲生髓饮的通络治疗机制与肿瘤抗血管生成机制具有一致性,从而为中医学对卵巢癌的深入认识以及从络病论治提供新的思路。

中药复方理冲生髓饮对Casp-8和CXCL2基因在人卵巢癌细胞株SKOV3中表达的影响

目的:采用基因芯片技术研究理冲生髓饮对人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3的作用机制。方法:Wistar大鼠随机分组,灌胃给药,采血制备含药血清。提取对照组及理冲生髓饮组肿瘤细胞mRNA,制备DNA探针并分别用Cy3和Cy5两种荧光染料标记,与基因表达谱芯片进行杂交,经扫描、分析,得出药物作用后表达有差异的基因。结果:共筛选出显著表达差异基因136种,其中16种基因表达水平下调,120种基因表达上调。结论:理冲生髓饮对卵巢癌细胞株SKOV3的生长有抑制作用,促进肿瘤细胞凋亡和抑制血管生成可能是其作用机制。

中药复方药物血清对CDKN2A和RPS3a基因在人卵巢癌细胞株SKOV3中表达的影响

目的研究CDKN2A(细胞周期依赖性激酶抑制基因)和RPS3a基因(核糖体蛋白质S3a)在中药复方理冲生髓饮诱导人卵巢癌细胞株人卵巢浆液性乳头状囊腺癌(SKOV3)细胞凋亡中的作用。方法将20只Wistar大鼠随机分为理冲生髓饮组和生理盐水组,灌胃给药,采血制备含药血清。提取生理盐水组及理冲生髓饮组肿瘤细胞mRNA,制备DNA探针并分别用Cy3和Cy5两种荧光染料标记,与人细胞凋亡寡核苷酸微阵列芯片进行杂交,经扫描、分析,得出药物作用后表达有差异的基因。结果共筛选出显著差异表达基因66个,其中20个基因表达水平上调,46个基因表达水平下调。结论理冲生髓饮可能通过上调CDKN2A基因和下调RPS3a基因,达到诱导卵巢癌细胞凋亡的目的。诱导细胞周期停滞,阻碍肿瘤细胞蛋白质合成,影响细胞正常代谢等,可能是其诱导细胞凋亡的作用机制。

中药复方药物血清对FADD和MCL-1基因在人卵巢癌细胞株SKOV3中表达的影响

目的研究FADD和MCL-1基因在中药复方理冲生髓饮诱导人卵巢癌细胞株SKOV3细胞凋亡中的作用。方法 Wistar大鼠随机分组,灌胃给药,采血制备含药血清。提取生理盐水组及理冲生髓饮组肿瘤细胞mRNA,制备DNA探针并分别用Cy3和Cy5两种荧光染料标记,与人细胞凋亡寡核苷酸微阵列芯片进行杂交,经扫描、分析,得出药物作用后表达有差异的基因。结果共筛选出显著表达差异基因66种,其中20种基因表达水平上调,46种基因表达水平下调。结论理冲生髓饮能够抑制细胞增殖并诱导其凋亡,其细胞凋亡机制与上调FADD基因和下调MCL-1基因有关。

利用基因芯片技术阐述中药复方对卵巢癌细胞株SKOV3的作用机制

目的:研究理冲生髓饮对人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3的治疗作用,并利用基因表达谱芯片探索其作用机制。方法:Wistar大鼠随机分组,灌胃给药,采血制备含药血清。提取对照组及理冲生髓饮组肿瘤细胞mRNA,制备DNA探针并分别用Cy3和Cy5两种荧光染料标记,与基因表达谱芯片进行杂交,经扫描、分析,得出药物作用后表达有差异的基因。结果:共筛选出显著表达差异基因136种,其中16种基因表达水平下调,120种基因表达上调。结论:理冲生髓饮对SKOV3生长有抑制作用。

基于“肾阳虚衰,血瘀于胞”探讨卵巢癌发病机制

卵巢癌是妇科常见肿瘤之一,其发病率近年来有上升的趋势,属中医"癥瘕"、"肠蕈"、"腹痛"等范畴。本文主要从中医入手,着重论述卵巢癌的病因病机与"肾阳虚衰,血瘀于胞"密切相关,而理冲生髓饮的建立正是基于"肾阳虚衰,血瘀于胞"。