基于理性设计策略提高呕吐毒素解毒酶DepB的催化活性

[目的]呕吐毒素(DON)广泛存在于粮谷类原料及其制品中,对人和动物的健康都造成严重危害。然而,现有呕吐毒素解毒酶DepB存在种类少、催化性能差等问题,限制了其在食品加工和饲料中的应用。本研究采用理性设计策略对呕吐毒素解毒酶DepB进行分子改造,以提高DepB的催化活性。[方法]通过对底物10范围内的氨基酸残基进行丙氨酸和甘氨酸扫描,确定突变“热点”氨基酸残基。随后,采用定点饱和突变和组合突变技术筛选得到催化活性显著提高的突变酶,并对其进行三维结构模拟和分子动力学模拟,分析其催化活性提高的分子机制。[结果]通过筛选获得了催化活性显著提高的三点突变酶A289V/A227R/S54N,该酶比活力为335.77 U·mg^(-1),是野生型DepB的2.25倍。三点突变酶的K m值由95.11μmol·L^(-1)下降到58.33μmol·L^(-1),k cat/K m值由5.99 mmol^(-1)·L·s^(-1)提高至16.94 mmol^(-1)·L·s^(-1),亲和力和催化效率均显著提高。通过三维结构模拟和分子动力学模拟分析,发现空间位阻减小、静电相互作用增强、酶-底物-辅酶结合自由能降低是其催化活性提高的分子机制。[结论]基于理性设计策略提高了DepB的催化活性,强化了DepB的适用性能,为呕吐毒素解毒酶的分子改造及其在食品加工和饲料中的应用提供依据。

酶的理性设计在作物育种中的应用进展与前景展望

优良种质资源是粮食安全的重要保证,传统育种技术存在周期长、工作量庞大等问题。随着生物学与计算机技术的深度融合,针对作物关键基因进行定向优化的酶的理性设计,为更大限度挖掘优质基因资源奠定了基础,进一步与基因编辑及转基因技术相结合,成为分子育种技术探索中的重要方向之一。阐述了分子对接、分子动力学模拟、结合自由能评价等酶的理性设计常用方法,综述了酶的理性设计在提高作物品质、抗逆性和生物量方面的应用进展,并对未来的前景进行展望,以期为作物育种新技术的开发和利用提供参考。

枯草芽孢杆菌漆酶的理性设计及在霉菌毒素降解的应用

为解决目前制约食品等领域发展的霉菌毒素污染问题,选取了枯草芽孢杆菌来源的BsCotA漆酶并且通过理性设计提高酶活力、稳定性,从而实现对霉菌毒素降解效率的提高。利用理性设计改造BsCotA漆酶,获得了4个突变体漆酶,包括3个点突变体CotA^(A344K)、CotA^(A317T)、CotA^(T36Y),和突变整合体CotAgold,使用毕赤酵母进行异源表达,测定其酶学性质,并检测其对霉菌毒素的降解效率。基于蛋白质结构进行设计的3个单点突变,均从不同程度上提高了漆酶的稳定性。而将3个突变位点同时整合到1个漆酶突变体上时,3个突变位点间未发生显著拮抗作用,使得突变整合体CotAgold展示出最好的稳定性以及催化能力;CotAgold比酶活力为99.4 U/mg,相比BsCotA的比酶活力提高了10倍,对于ABTS的k_(cat)/K_(M)达到了7.12×10^(5)L/(mol·s),相比BsCotA提高了1.9倍;突变体CotAgold的最适反应pH值为4,最适反应温度均为70℃,与野生型BsCotA催化条件保持一致;CotAgold在pH 2~12,孵育30 min,剩余酶活力均在70%以上,相比野生型BsCotA在酸性条件下的稳定性有明显提高;CotAgold在40~90℃,孵育30 min,残留酶活力均在90%以上,相比野生型BsCotA在高温条件下的稳定性有明显提高;并在ABTS阳离子自由基作为介体的条件下,漆酶CotAgold能完全降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮;相比之下,野生型漆酶BsCotA的降解率仅为5%。通过蛋白质的理性设计得到了漆酶突变体CotAgold,表现出显著提高的pH稳定性以及热稳定性,蛋白表达量也有一定的提高,在霉菌毒素降解等领域具有良好的应用前景。

色氨酸羟化酶2理性设计提高大肠埃希菌5-羟基色氨酸产量

色氨酸羟化酶(TPH)可催化色氨酸羟化为5-羟基色氨酸(5-HTP),是5-HTP生物合成过程中的关键酶。为了提高大肠埃希菌细胞工厂合成5-HTP的效率,通过酶的理性设计和定点突变技术构建了人色氨酸羟化酶2(TPH2)的系列突变体,并在高产L-色氨酸且含有TPH辅酶四氢生物蝶呤(BH_(4))合成与再生模块的大肠埃希菌中表达。发现适当降低酶和色氨酸、酶和BH_(4)间结合的氢键数目有助于提高5-HTP产量;酶和底物色氨酸结合情况不变,辅酶BH_(4)与酶间氢键数目越多,5-HTP产量越低。5-HTP产量最高的细胞工厂是由突变酶V195A/V197I构建的,5-HTP产量较野生酶构建的细胞工厂产量提高54%,1 L补料摇床发酵48 h,5-HTP产量达16.17 g/L。理性设计是提高TPH2酶活,突破5-HTP合成限速步骤的有效途径,TPH2和底物色氨酸、辅酶BH_(4)间氢键连接太多或太少都不利于其催化活性的发挥。

靶向瞬时受体电位香草酸亚型1离子通道的Nplus-RhTx多肽抑制剂理性设计及功能验证

目的:获得靶向瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)通道的多肽抑制剂。方法:基于已有的靶向TRPV1通道的多肽激动剂红头蜈蚣毒素(RhTx)进行理性设计,在其氨基末端增加带正电荷的氨基酸,并在细胞上使用膜片钳电生理验证设计的多肽对TRPV1通道的抑制作用。结果:理性设计了8条Nplus-RhTx多肽,在膜片钳电生理记录中发现其中4条可以抑制TRPV1的辣椒素激活,4条Nplus-RhTx多肽的半数有效抑制浓度分别为(188.3±4.7)、(193.6±18.0)、(282.8±11.9)和(299.5±6.4)µmol/L。结论:通过对RhTx多肽的氨基端进行理性设计改变其性质,可获得靶向TRPV1的多肽抑制剂。

基于理性设计的截短干酪乳杆菌转化酶的表达鉴定

该研究从千岛湖土壤样品中筛选产生转化酶的菌株,并对其进行鉴定。从干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)互补脱氧核糖核酸(cDNA)中扩增干酪乳杆菌转化酶基因(LevH1),并构建大肠杆菌(Escherichia coli)获得重组干酪乳杆菌转化酶LevH1-LC。在酶的理性设计的基础上,通过基因截短技术获得4株转化酶截短体LevH1-LC-N、LevH1-LC-C、LevH1-LC-NC和LevH1-LC-M,并对其酶学性质进行研究。结果表明,筛选得到一株产转化酶的优良菌株LC23,经鉴定其为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),酶活力为0.06 U/mL。重组干酪乳杆菌转化酶LevH1-LC酶活力为8.37 U/mL,比天然转化酶的活性高138倍。与重组干酪乳杆菌转化酶LevH1-LC相比,截短体LevH1-LC-N、LevH1-LC-NC的酶活性分别增加了4.1倍和6.6倍,较天然转化酶活性提高了568.5倍和923.7倍。酶动力学分析结果表明,截短体LevH1-LC-NC的催化效率最高,是重组干酪乳杆菌转化酶LevH1-LC的29.7倍,其最适反应温度、pH分别为50℃、6.0,热稳定性及pH稳定性良好。因此,截短体LevH1-LC-NC为优质转化酶突变体。

基于工业基因的理性设计——天津卷烟厂设计

工业建筑是为满足特定产品生产或研发试制需要,容纳主要及辅助生产功能的建筑,其空间形态需与工艺流程及生产设备所需环境性能要求相吻合,强调生产空间布局的集约性、逻辑性、连续性及人流、物流的便捷和高效,同时需结合项目用地环境回应建筑的城市属性,进行建筑本体的空间再造,完成工艺流程和产品生产、研发试制条件约束下的功能实现与形式建构的统一。通过天津卷烟厂项目的创作实践,阐述基于工业基因的理性设计和建筑性表达。

市政给排水设计合理性的提升措施研究

现阶段,在城市给排水设计过程中,设计者要将环保、一致性、目标性等基本准则严格遵守,并与给排水工程施工要点相结合,保证布局的科学性,最大限度地降低资源的浪费。满足人们对生活用水的需要。在城市的发展过程中,要主动地采取有效的措施来改善城市的给水、排水设计,提高水资源的利用效率,为人们创造一个更好的居住条件,从而促进城市的高品质发展。

市政给排水设计合理性的提升策略及其研究

市政给排水设计合理性对城市的发展和居民生活质量有着重要的影响。本研究旨在提出提升市政给排水设计合理性的策略,以满足城市规划和未来发展的需求,通过分析目前市政给排水系统的现状和存在的问题,提出了一系列的改进和优化方案。研究结果显示,优化管网布局、提高排水效率、加强智能监控与管理、推广可持续技术等策略是提升市政给排水设计合理性的有效途径。

设计与理性:人工智能设计的美学反思

本文首先梳理了人工智能设计发展的历程并试图对其进行定义与分析:人工智能设计主要指的是人工智能程序自动或者半自动地生成艺术设计类产品的过程。其次,本文从美学角度对人工智能设计进行如下反思:一是探讨人工智能时代的新的人机关系,是对抗还是重生,并指出了人工智能对设计主体性的挑战和改变;二是延续本雅明与阿多诺对机械复制时代的争论,认为人工智能设计是智能文化工业的体现,并深入探讨人工智能设计中自由与限制、确定性与偶然性的冲突;三是提出“设计理性”概念,并认为其是对工具理性的反思与超越。人工智能设计的美学反思需要我们对人机关系进行重新解读,机器是对人的辅助而非取代,我们应避免人工智能对创意领域的过度渗透,实现可控情况下人机的和谐共生。

植物乳杆菌植酸酶理性设计及表达鉴定

植酸酶能将植酸水解成肌醇衍生物,并释放出无机磷酸,是一种重要的生物催化剂。植酸酶的热稳定性和比活性是决定其潜在应用价值的2个关键因素。该研究从植物乳杆菌中克隆到了具有233个氨基酸残基、高活性的植酸酶基因(LpPHY233),并在大肠杆菌中实现了高水平的异源表达,其表达水平是植物乳杆菌的800倍。基于理性设计的结果,通过二硫键工程显著提高了Lp PHY233的温度特性和催化性能。突变体Lp PHY233S58C/K61C的最适反应温度较Lp PHY233提高了15℃。此外,它还具有良好的pH特性和动力学参数,在食品加工和饲料添加剂领域具有较大的应用前景。该研究结果为植酸酶的进一步分子修饰和工业应用提供了坚实的理论基础。

半理性设计提高甲酸脱氢酶(Cb FDH)活力及热稳定性

甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)是NADH循环再生的最佳酶之一,广泛应用于食品、医药和化工等行业。但是野生型甲酸脱氢酶普遍存在酶活低、催化效率差等缺点,导致产品转化率较低,影响产品的工业化生产。为了获得具有更佳催化性能的甲酸脱氢酶,作者以博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)来源的甲酸脱氢酶为模板,利用HOTSPOT WIZARD v3.1进行三维结构模拟预测,构建了P68G、Q197K两个突变体,比酶活较野生型分别提高了11%和33%。这是由于P68G氨基酸残基侧链的苯环被氢取代,减少了甲酸盐底物进入口袋的空间位阻;而Q197K侧链酰胺基突变为胺丁基增强了酶的柔性。然而这两个突变点对甲酸脱氢酶的热稳定性产生了负面影响,因此在I239位引入半胱氨酸突变与C262构成二硫键以提高其热稳定性,最终获得一株热稳定性显著提高,比酶活较野生型提高31%、较I239C提高45%的突变株Cb FDH Q197K/I239C。通过半理性预测蛋白质结构提高了甲酸脱氢酶的活力和热稳定性,为高效构建性能稳定、还原力强的甲酸脱氢酶提供了理论基础。

理性设计提高奥氏嗜热盐丝菌精氨酸脱亚胺酶的热稳定性

奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)来源的精氨酸脱亚胺酶具有催化精氨酸水解生成瓜氨酸的活性,但其热稳定性有待进一步提升。为此,该研究对此来源的精氨酸脱亚胺酶进行三维结构分析和理性设计,选择了10个单点突变体。通过分子克隆、表达纯化和变性温度(T_(m))测定,获得了2个酶活力稍降低但热稳定性提高的突变体T180Y和A190P,有序叠加后获得双点突变体T180Y/A190P,3个突变体的T_(m)值分别提高了2.5、1.9、5.2℃,相比于野生酶,3个正向突变体在50℃下保温180 min后,残余酶活力分别提高了30%、23%和41.8%。三维结构分析表明表面空穴填充和芳香环作用可能是T180Y热稳定性增强的原因,而A190P推测是由于脯氨酸的吡咯环刚性结构以及与空间相邻残基之间的疏水相互作用增强了其热稳定性。随后,将突变体应用于瓜氨酸的生产,双点突变体T180Y/A190P的生产速率和瓜氨酸产量均高于野生型。该研究为其他工业酶的理性设计提供了一定参考依据。

乙酰胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐衍生物的理性设计

阿尔茨海默症是老年人群中常见的慢性神经退行性疾病,严重损害老年人健康与生活质量.目前临床常使用乙酰胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐等作为治疗药物.本文通过分子模拟方法研究了多奈哌齐和乙酰胆碱酯酶的作用模式;基于研究结果,对多奈哌齐衍生物进行理性设计,获得了化合物1.分子对接及药代动力学性质预测结果显示,化合物1具有和多奈哌齐相似的作用模式和成药性质.同时,分子静电势表面分布结果显示,甲基的引入可增强化合物1与关键氨基酸残基F295之间的氢键相互作用,可能具有较多奈哌齐更理想的活性.此外,化合物1能制备得到稳定的光学纯异构体;有利于减少临床上药物的使用量,降低副作用发生几率,具有进一步研究的价值.

基于理性设计提高1,3-丙二醇氧化还原酶的稳定性和活性

1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol oxidoreductase,PDOR)是甘油生物合成1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)的关键限速酶之一。使用PoPMuSiC 2.1计算肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)来源PDOR(KpPDOR)突变的折叠自由能,结合HotSpot Wizard 3.0对催化中心附近氨基酸的功能热点分析和保守残基鉴定,理性选取突变位点,构建定点突变。经诱导表达、蛋白纯化和酶学性质研究,获得催化性能、热稳定性和pH耐受性提高的突变体。V155N突变体在37℃,pH 7.5下的还原活性为KpPDOR的1.7倍,pH 4.0时是KpPDOR的2.5倍。N262E突变体37℃下半衰期为KpPDOR的1.4倍。分析蛋白结构,发现Val155突变为Asn导致新形成两个氢键,稳定了Val155所在的β-折叠结构。而Asn262突变为Glu形所成的两个氢键,可增强催化中心刚性,提升酶稳定性。静息细胞转化甘油合成1,3-PD,发现突变体V155N工程菌株1,3-PD产能为1.16 mmol/L/OD_(600),高于野生型KpPDOR工程菌株的0.82 mmol/L/OD_(600)。此理性设计方法对改良其他工业酶的性能有一定参考价值。

设计改造羧酸还原酶合成医药中间体(S)-2-氨基丁醇

(S)-2-氨基丁醇同时具有羟基及氨基官能团,是多种重要药物分子的关键手性中间体,生物合成(S)-2-氨基丁醇尚缺少有效的酶元件。以塞格尼氏菌(Segniliparus rugosus)来源的羧酸还原酶SrCAR为研究对象,通过对实验室已有SrCAR突变文库进行筛选测试,结合活性位点共进化分析,同时利用组合活性中心饱和突变策略(Combinatorial active-site saturation test,CAST)构建新的突变体文库,经测试最终获得优势突变体XH7(G430V/E533F/A627N)。该突变体催化底物N-Boc-(S)-2-氨基丁酸到醛产物的活性(kcat/Km)较野生型SrCAR提高2.1倍,热熔值(Tm)提升2.3℃。进一步通过引入荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)来源的醇脱氢酶PfADH,可还原N-Boc-(S)-2-氨基丁醛到醇产物。XH7和PfADH的双酶共表达体系反应5 h即可将20 mmol/L底物实现几乎完全转化,转化率达到99%,并经脱Boc保护与分离纯化获得终产物(S)-2-氨基丁醇,得率为60%。通过分子动力学模拟解析最优突变体活性及热稳定性提高的分子机制,为SrCAR酶设计改造提供新的研究思路,拓展酶法合成(S)-2氨基丁醇的生物酶工具箱,可为类似高附加值医药中间体的生物合成提供理论和实践指导。

基于理性设计的烟酰胺核糖激酶活性提升及应用

烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是NAD+的前体,补充NMN可有效恢复体内NAD+水平,并改善与NAD+下降相关的病理状态和疾病.目前NMN主要通过酶法生产,但是酶的催化活性较低,使得酶法合成NMN的成本仍然较高.来源于人的烟酰胺核糖激酶NRK1可以催化ATP和烟酰胺核糖合成NMN,因此,以提升烟酰胺核糖激酶NRK1的催化活性为目的,利用理性设计的策略和定点突变技术,通过氨基酸序列比对和结构分析,设计了NRK1的2个突变体NRK1(T47V)和NRK1(N62D),并在大肠杆菌中成功表达.实验表征发现,二者的催化特性均得到了提升,且NRK1(T47V)具有更好的催化特性,其活性较NRK1提高130%,催化效率k_(cat)/K_(m)和稳定性分别较NRK1提高了100%和20%.在较大反应体系中反应100 min时,NRK1(T47V)催化底物烟酰胺核糖的转化率为78%,较NRK1提高15.4%,产物NMN的产量为4.13 g/L,较NRK1提高38%.该结果表明,活性中心附近氨基酸的理性突变能显著提高NRK1酶的催化活性.

基于计算设计的GH11家族木聚糖酶CDBFV的热稳定性改造及潜在机制研究

【目的】瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum GH11家族木聚糖酶CDBFV在饲料、食品等领域具有良好应用前景,提高其热稳定性对其生产应用十分重要。【方法】使用分子动力学模拟、机器学习等策略设计潜在CDBFV热稳定性突变体,在大肠杆菌和毕赤酵母中进行异源表达纯化,测定最适反应条件、比酶活和85℃孵育3 min后相对剩余活力,通过结构分析明确热稳定性提高机制。【结果】位于CDBFV N端基序~(36)GNNS~(39)具有较高柔性,对其改造设计的单突变体N37P和N38V在85℃孵育3 min后,相对活力分别降低至70.3%和55.1%,较野生型(48.7%)提升了21.6%和6.5%;进而,在相对活力提升显著的N37P基础上叠加已报道优势突变体N88G,构建双突变体N37P/N88G,其相对活力达到了73.4%,较野生型提高了24.7%;此外,将N37P/N88G在毕赤酵母中进行了分泌表达,在85℃处理3 min后,相对活力达到了88.8%;结构分析表明,N37P突变的引入使得CDBFV形成了新的氢键相互作用,降低活性位点附近柔性,并干预了糖基化形成,进而提高了热稳定性。【结论】成功得到了高耐热双突变体N37P/N88G,为提高GH11家族木聚糖酶的热稳定性改造提供了新的思路和方法,有望推动CDBFV在饲料工业等高温环境下的广泛应用。

荷兰风格派对包豪斯设计理念转变的影响

研究了荷兰风格派对包豪斯设计理念的影响,分析了风格派的设计理念在包豪斯理性设计中的体现,并阐述了风格派对现代设计发展的重要意义。结合荷兰风格派相关设计作品和代表人物,对荷兰风格派包豪斯设计中的体现进行多层面、多方位分析,总结了风格派对于理性主义设计和现代主义设计的深远影响。

机器与社会理想:莫西·金兹堡的构成主义功能性设计方法逻辑探析

20世纪20年代,金兹堡面对新旧风格之交替、艺术与技术的争辩提出了一种集社会理想与机器性为一体的建筑设计方法—“功能性设计方法”,其成为各先锋思潮在建筑本体域的一次聚合与重要接驳点。然而鉴于政治因素之介入,功能方法一度在建筑历史理论研究中处于失语状态。文章将从功能方法之历史时代特征出发,探究其思想之源并着重探析其以社会理想为目标、内化于机械生产逻辑的机器范式,揭示其对构成主义建筑理论与现代主义理性设计方法的重要奠基作用。