琥珀蚕线粒体全基因组测序及序列分析

【目的】分析昆虫的线粒体基因组能很好地指示昆虫物种的亲缘关系。本研究旨在探索琥珀蚕Antheraea assama线粒体基因组并在线粒体水平上了解大蚕蛾科(Saturniidae)属及种间的分子系统进化关系。【方法】采用PCR步移法并结合克隆测序的策略,测定了珍稀绢丝昆虫琥珀蚕的线粒体基因组全序列,分析其结构特点和碱基组成;采用邻近距离法(NJ)构建大蚕蛾科及外群共14种昆虫线粒体蛋白质编码基因的系统发育树,并分析琥珀蚕在大蚕蛾科中的系统发育关系。【结果】琥珀蚕线粒体基因组序列全长15 312 bp(Gen Bank登录号:KU301792),包含13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个核糖体rRNA基因和一段332 bp的A+T富集区,呈现典型的鳞翅目昆虫线粒体基因组的核苷酸组成及基因排布顺序。分析结果表明,琥珀蚕线粒体基因组中A+T含量高达80.18%,13个蛋白质编码基因中,除了COX1以CGA为起始密码子,其他均为典型的起始密码子ATN。COX1、COX2和ND5均以不完整的T为终止密码子,其余基因都是以典型的TAA或TAG为终止密码子。预测的22个tRNA二级结构中,除tRNASer(AGN)缺乏DHU臂外,其他21个tRNA均能形成典型的三叶草结构。由线粒体蛋白质基因串联序列构建的NJ系统发育树表明,琥珀蚕与柞蚕Antheraea pernyi、天蚕Antheraea yamamai、明目大蚕Antheraea frithi构成鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属Antheraea这一分支。在9种大蚕蛾科昆虫中,琥珀蚕与柞蚕属的天蚕亲缘关系最近,与巨大蚕蛾属Attacus的乌桕大蚕Attacus atlas亲缘关系较远。【结论】琥珀蚕线粒体基因组的基因排列方式同其他已测定的鳞翅目昆虫的完全相同。基于线粒体基因组的大蚕蛾科昆虫系统发育关系与传统的形态分类学结果一致,即琥珀蚕隶属于柞蚕属Antheraea。

高温和低温条件下琥珀蚕血淋巴SOD及CAT活性的变化

为研究琥珀蚕在高温和低温胁迫条件下,血淋巴超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性变化规律。对5龄琥珀蚕第3天幼虫分别进行38℃高温和4℃低温胁迫处理3 h,以室温26℃饲养作对照,在处理停止后0、3、6、9、12 h取血淋巴,测定SOD和CAT的活性变化。结果表明:38℃高温处理,引起琥珀蚕血淋巴SOD和CAT活性均呈现出先升高后降低趋势,在处理停止后3 h分别达到1个峰值86.30 U/m L和108.15 U/m L,随后逐渐减弱,最终与对照组持平。4℃低温胁迫,SOD活性也是在处理停止后3 h出现1个峰值59.30 U/m L,随即开始逐渐减弱,在12 h接近对照组;而CAT酶活性先下降,并低于对照,在3 h出现1个最低值11.09 U/m L,随后开始升高,在6 h达到1个峰值88.68 U/m L,随后再逐渐下降并接近对照。

琥珀蚕内参基因的克隆及表达稳定性检测

琥珀蚕（Antheraea assama）是一种重要的野蚕种质资源。为了开展琥珀蚕功能基因的研究,选择合适的内参基因非常必要。通过c DNA末端快速扩增技术获得琥珀蚕功能基因研究的3个常用内参基因β-actin、GAPDH和18S rRNA的c DNA全长序列,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析3个基因在蚕体不同组织中的转录水平,并利用标准化分析软件ge Norm和Norm Finder分析其表达的稳定性。结果显示,3个内参基因的表达稳定性依次为β-actin、GAPDH、18S rRNA。就组织表达而言,β-actin在幼虫的中肠、脂肪体、马氏管、气孔、丝腺和卵巢以及蛹的输卵管中表达相对稳定;就发育时期的表达而言,β-actin在蛾期的表达也相对稳定。此外,GAPDH在幼虫头部、表皮和血液中的表达相对稳定;18S rRNA在幼虫精巢中的表达相对稳定。对琥珀蚕功能基因表达进行qRT-PCR所需内参基因数量的分析表明,选用2个内参基因即可满足试验需求。

琥珀蚕成虫触角的超微结构观察

琥珀蚕(Antheraea assama)是一种珍贵的野蚕资源,研究成虫触角感器的形态结构对阐明其嗅觉行为和识别机制有重要意义。用扫描电子显微镜观察琥珀蚕成虫触角表面的结果表明:成虫的触角有4种感器,分别是毛形感器、锥形感器、刺形感器和腔锥形感器,其中毛形感器数量最多,腔锥形感器较少;雌性与雄性成虫的触角外形、感器数量和种类都有明显的差异,雄蛾触角呈羽状且较宽,毛形感器Ⅰ和腔锥形感器仅分布于雄蛾的触角,而雌蛾触角呈栉齿状且较窄,毛形感器Ⅱ、锥形感器和刺形感器为雌、雄成虫所共有。琥珀蚕成虫触角感器的类型总体较少(雄蛾有4种,雌蛾有3种),从雌、雄成虫触角毛形感器的分布差异初步推测,雄蛾特有的毛形感器Ⅰ具有探测性信息素化合物的功能,雌、雄成虫共有的毛形感器Ⅱ主要用于探测寄主植物化学信息。

琥珀蚕热激蛋白基因Hsp90的克隆和高低温胁迫下的表达分析

热激蛋白(heat shock protein,HSP)是生物体应对不良环境胁迫的关键蛋白,HSP90是热激蛋白家族中的重要成员。琥珀蚕(Antheraea assamensis)是一种半驯养的经济昆虫,在生长过程中常受到高低温等不利环境条件的冲击。从琥珀蚕中克隆得到AaHsp90基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:MK1656641),该序列长2482 bp,包括126 bp的5′非编码区(5′UTR)和202 bp的3′非编码区(3′UTR),开放阅读框为2154 bp,编码717个氨基酸,预测蛋白质分子质量为824 kD,等电点为500。AaHSP90氨基酸序列含有HSP90家族的5个特征序列及C末端的胞质保守基序MEEVD,氨基酸序列同源比对结果表明其与天蚕和柞蚕的同源序列相似度分别达到981%和990%。实时荧光定量PCR结果表明,该基因mRNA在琥珀蚕卵、幼虫期各龄及5龄第4天不同组织中均有表达;相对于对照组,在高温胁迫条件下其表达量显著上调,低温刺激条件下其表达则受到抑制。研究表明AaHsp90基因在琥珀蚕对环境温度适应中起重要作用。

不同温度和饥饿胁迫下琥珀蚕AaHsp90基因的表达特征

为了探究高温、低温和饥饿胁迫对琥珀蚕热激蛋白AaHsp90基因表达水平的影响,揭示琥珀蚕适应环境的分子机制,对5龄第3天琥珀蚕幼虫分别进行38℃高温、4℃低温和饥饿胁迫处理,以26℃正常饲养组为对照,采用实时荧光定量PCR检测分析中肠、脂肪体和血淋巴AaHsp90基因的相对表达量变化情况。结果表明,在测定的时间范围内,38℃高温处理后,中肠、脂肪体和血淋AaHsp90基因的表达量均呈现先明显增加,后随着处理时间的延长急剧减弱的趋势。4℃低温处理对琥珀蚕幼虫中肠、脂肪体和血淋巴Aahsp90基因的表达有一定的抑制作用。饥饿处理组中,琥珀蚕血淋巴、脂肪体和中肠AaHsp90基因在饥饿12 h和18 h呈现上调表达趋势,而在饥饿24 h时,AaHsp90基因的表达量急剧降低。综上可知,高温和饥饿胁迫能诱导琥珀蚕Aahsp90基因的表达,而低温胁迫主要抑制AaHsp90基因的表达,提示AaHsp90蛋白在琥珀蚕幼虫适应高温和饥饿胁迫的过程中发挥了重要作用。

印度琥珀蚕养殖技术

介绍了印度琥珀蚕的产业情况,琥珀蚕在印度的养殖技术、制种技术及茧丝利用现状。

琥珀蚕孵化酶基因AaHE的克隆及启动子活性分析

【目的】琥珀蚕Antheraea assama具有典型的野蚕特征,蚕卵孵化不齐,严重影响琥珀蚕的室内规模化饲养。本研究旨在探究对琥珀蚕卵孵化起关键作用的孵化酶(hatching enzyme)基因及其启动子序列特征,为进一步选择合适的抑制剂或促进剂调节琥珀蚕卵的孵化奠定基础。【方法】采用RACE技术克隆琥珀蚕孵化酶基因的cDNA全长序列,对基因序列进行生物信息学分析;采用qRT-PCR检测琥珀蚕孵化酶基因在琥珀蚕不同发育天数卵中及5龄第3和4天幼虫不同组织(丝腺、马氏管、头、中肠、脂肪体、表皮、血液、精巢和卵巢)中的表达情况;采用染色体步移克隆琥珀蚕孵化酶基因的启动子序列,构建昆虫细胞重组表达载体转染家蚕Bombyx mori BmN细胞,检测琥珀蚕孵化酶基因启动子活性。【结果】获得了琥珀蚕孵化酶基因AaHE(GenBank登录号:KT336227.1)全长cDNA序列,长993 bp,编码294个氨基酸,预测蛋白质分子质量为33.7 kD,理论等电点为5.17。AaHE氨基酸序列含有一个信号肽和一个ZnMc结构域,AaHE是一种含有HExxH锌结合位点的锌依赖性蛋白水解酶,该类酶既是肽酶,同时又是一种消化酶。AaHE在琥珀蚕孵化前的卵及5龄幼虫中肠中特异性高表达,分别与AaHE的肽酶和消化酶的属性相吻合。AaHE启动子核心区存在多个转录因子结合位点,这可能与转录因子参与调节AaHE的表达有关。启动子活性分析表明,AaHE启动子在家蚕BmN细胞中能够启动EGFP基因的表达,具有明显的启动子活性。【结论】AaHE是锌依赖性蛋白水解酶,其启动子核心区存在多个转录因子结合位点。本研究为选择合适的抑制剂或促进剂调节琥珀蚕卵的孵化率提供了参考。

琥珀蚕丝腺转录因子基因AaSGF-1的克隆、原核表达及组织表达分析

【目的】本研究旨在克隆琥珀蚕Antheraea assama丝腺转录因子基因AaSGF-1,分析其序列特征及表达模式并制备多克隆抗体,为探讨该基因的生理功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从琥珀蚕丝腺中克隆AaSGF-1的cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用qPCR检测AaSGF-1在琥珀蚕5龄第4天幼虫不同组织(头、中肠、脂肪体、丝腺、血液、表皮)中的表达模式;构建原核表达质粒载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达AaSGF-1,利用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔子,获得高效的抗体。利用免疫荧光技术检测AaSGF-1在琥珀蚕蚁蚕丝腺和表皮及4龄幼虫丝腺中的表达情况。【结果】克隆了琥珀蚕AaSGF-1的cDNA序列(GenBank登录号:MK889510.1),开放阅读框(ORF)序列长1050 bp,编码349个氨基酸残基,预测蛋白分子质量为38.8 kD,理论等电点(pI)为8.74。qPCR检测结果显示AaSGF-1在琥珀蚕5龄幼虫丝腺组织尤其是后部丝腺中高量表达,而在其他组织中几乎不表达。免疫荧光结果表明AaSGF-1在蚁蚕及4龄幼虫的丝腺中表达。【结论】本研究原核表达了琥珀蚕AaSGF-1,制备了多克隆抗体,证实了AaSGF-1在琥珀蚕幼虫的丝腺中高表达,为进一步研究该基因在琥珀蚕丝腺发育及丝蛋白合成中的作用奠定了基础。

琥珀蚕胆绿素结合蛋白基因AaBP-1的克隆及表达分析

鳞翅目昆虫的胆绿素结合蛋白属脂质运载蛋白家族,通过与胆色素(bilins)结合在蓝绿色素形成过程中发挥重要作用。从琥珀蚕(Antheraea assama)丝腺中克隆了胆绿素结合蛋白基因1(AaBP-1),该基因cDNA全长923 bp,开放阅读框609bp,编码202个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为22.1 kD,理论等电点为5.19,蛋白序列含有1个信号肽和1个Lipocalin超家族结构域。序列比对分析结果表明,AaBP-1的氨基酸序列与柞蚕胆绿素结合蛋白BP-1一致性较高,达到81.7%。荧光定量PCR检测结果显示AaBP-1基因mRNA在琥珀蚕5龄第4天幼虫的表皮和丝腺中高量表达,在头和中肠中少量表达,其他组织中都几乎不表达。在丝腺中,AaBP-1主要在前部丝腺和中部丝腺表达,尤其在中部丝腺的前部大量表达,且琥珀蚕丝腺的颜色也呈现出中部丝腺比后部丝腺深的现象。推测AaBP-1可能参与琥珀蚕表皮、丝腺及茧中色素的形成。研究结果将为进一步研究琥珀蚕色素形成机制提供参考。

利用硫氰酸锂水溶液提取云南琥珀蚕茧壳丝蛋白的适宜条件研究

琥珀蚕(Antheraea assama)是一种具有重要利用价值的经济昆虫,其蚕丝特性优良,在纺织、生物医药、生物材料等领域有较好的开发利用潜力。本研究利用硫氰酸锂水溶液提取琥珀蚕茧壳丝蛋白,结果表明:部分琥珀蚕丝蛋白可得到提取,且提取效率随提取温度的升高而提高。在设置的最高水浴温度60℃条件下提取12 h后得到的蛋白浓度为10.257 mg/mL,溶解率为8.91%;在60℃溶解条件下进行超声处理(53 kHZ,500W)12 h,蛋白浓度为14.552 mg/mL,溶解率达16.93%。SDS-PAGE凝胶电泳检测提取的丝蛋白,显示不同处理条件下提取的丝蛋白条带无明显差异,丝蛋白无明显降解。提取的丝蛋白在浓度和质量上都可满足实验室研究的需要。

琥珀蚕的生物学特性

琥珀蚕（Antheraea assamensis Helfer，1837）属鳞翅目（Lepidoptera）大蚕蛾科（Saturniidae）柞蚕属（Antheraea）昆虫，利用其茧缫制的琥珀蚕丝，具有金黄色光泽，产量少，价格极其昂贵，现今只有印度从事琥珀蚕丝的研究及生产工作。本文通过野外考察，收集资源进行室内饲养，记述了各虫态的形态特征、生活史、生活习性。琥珀蚕在云南西双版纳1年发生3～4代，喜高温多湿，喜食天竺桂、香樟、假柿木姜子等多种樟科植物，以蛹越冬。成虫首次出现在3月上中旬，第3代出现在9月底10月初。室内饲养24～28℃，80%～95%条件下，卵期8～12 d，幼虫4眠5个龄期，历期24～35 d，蛹期18～30 d，成虫4～12 d。

有一种手工织品叫真木千秋——访真木千秋和她的丝织灵物

有一种手工织品叫真木千秋,接触她和她织品的人都会被迷住,着迷的不仅是面料和工艺本身,更多是向一种情感和坚持致敬。她深入被称为"世界尽头"的地方冒险采集野蚕丝,为了做成功这样的纯生丝,在印度呆了20多年。她的所有织物均采用天然原料、纯手工纺织、纯植物染料染色,在亮丽浮华的世界里如此朴素的衣物,以独特的质感和魅力让人流连痴迷。本刊特邀MAKI TEXTILE STUDIO&SHOP创办人真木千秋女士讲述她的挚爱灵物和她的编织之道。