OXCT1基因缺陷致琥珀酰辅酶A:3-酮酸辅酶A转移酶缺乏症1例并文献复习

琥珀酰辅酶A:3-酮酸辅酶A转移酶(Succinyl-CoA:3-ketoacid CoA transferase,SCOT),基因位点标记OXCT1,EC 2.8.3.5,存在于多个组织的线粒体内,能将乙酰乙酸转化为乙酰乙酰辅酶A,乙酰乙酰辅酶A在乙酰乙酰辅酶A硫解酶(T2)的作用下分解为乙酰辅酶A后进入三羧酸循环。该酶是酮体代谢过程中的关键限速酶。先天性SCOT缺乏为常染色体隐性遗传病,1972年J.T.Tildon等首次进行了报道[1]。现对1例确诊的OXCT1基因突变导致的先天性SCOT缺乏病例进行分析总结,并通过复习相关文献归纳总结其特征,以便提高临床工作中对该病的认识,达到及时确诊、早期治疗的目的。

琥珀酰辅酶A转移酶的表达纯化及抗体制备

目的:琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)是酮体代谢过程中的关键限速酶,此酶缺陷多由SCOT基因突变引起,患者多有酮症酸中毒表现。为了进一步研究SCOT的功能,采用原核表达系统表达并纯化重组SCOT,制备SCOT多克隆抗体。方法:选择蛋鸡、肉鸡模式生物为研究对象,通过生物信息学对其抗原性和属间同源性进行分析,通过RT-PCR从鸡的骨骼肌cDNA中扩增了SCOT基因N端半长片段,克隆到表达载体pET28b中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组SCOT;用纯化的重组SCOT免疫小鼠后得到多克隆抗体。结果:Western印迹表明,制备的SCOT抗体具有较高的特异性,可特异性识别鸡的SCOT蛋白,同时可特异性识别小鼠和人的相应SCOT蛋白。结论:SCOT多克隆抗体的制备为后续在鸡、鼠和人中研究SCOT基因提供基础。

琥珀酰辅酶A转移酶硝基化酪氨酸位点特异单克隆抗体的制备

线粒体琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)含有4个酪氨酸残基,其4、76位点酪氨酸(Tyr4、Tyr76)的硝基化可导致其酶活性下降,制备特定的抗体可对其硝基化水平和位点进行检测。应用淋巴细胞杂交瘤技术,以化学合成的含琥珀酰辅酶A转移酶硝基化Tyr4和Tyr76肽段为半抗原,偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)后,作为免疫原免疫Balb/c小鼠,分离免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了多株融合细胞。经对融合细胞多次筛选和检测,最终获得4株单克隆抗体,分别对应SCOT Tyr4和Tyr76硝基化后表位,其间接ELISA检测效价分别达到1∶128 000、1∶32 000、1∶512 000和1∶4 096 000,表明抗体具有较强特异性和灵敏度。

阴道毛滴虫琥珀酰辅酶A合成酶基因的克隆与序列分析

目的获取阴道毛滴虫琥珀酰辅酶A合成酶(α-SCSB)全基因,并对其进行序列分析。方法利用PCR技术扩增阴道毛滴虫琥珀酰辅酶A合成酶(α-SCSB)全基因,并将其插入pMD18-T载体,酶切鉴定后进行序列测定及分析。结果PCR扩增获得α-SCSB全长基因,大小为1381bp,与国外发表的阴道毛滴虫琥珀酰辅酶A合成酶(α-SCSB)的基因同源性为100%。结论本研究获得了阴道毛滴虫琥珀酰辅酶A合成酶(α-SCSB)启动子,为下一步研究α-SCSB启动子的功能及构建阴道毛滴虫DNA稳定转染载体奠定了基础。

蛋白质琥珀酰化参与丁酸抑制胃癌细胞增殖及迁移的作用

目的:研究丁酸对胃癌细胞增殖及代谢的影响,并探讨其潜在作用机制。方法:使用5 mmol/L丁酸钠处理胃癌细胞48 h后,通过EdU染色及Transwell法检测细胞增殖、迁移情况;收集丁酸处理后的胃癌细胞,提取代谢物进行代谢组学分析筛选出其中显著富集的代谢通路以及上调的代谢物;采用Western blot以及细胞免疫荧光检测丁酸钠处理后胃癌细胞蛋白质琥珀酰化程度,同时采用RT-qPCR检测SIRT5、SUCLG1、SUCLG2和SUCLA2的mRNA水平。结果:丁酸钠处理48 h后胃癌细胞增殖被显著抑制,细胞中检测到三羧酸循环及氧化磷酸化等代谢通路显著富集,其中三羧酸循环代谢物L-苹果酸、琥珀酰辅酶A及延胡索酸显著上调(均P<0.05);Western blot和免疫荧光显示丁酸处理后胃癌细胞蛋白琥珀酰化水平上调(P<0.05)。同时RT-qPCR证实了丁酸处理上调了琥珀酰辅酶A合成酶编码基因SUCLG1、SUCLG2和SUCLA2的mRNA表达水平(均P<0.05),但并未影响SIRT5表达(P>0.05)。结论:丁酸能够抑制胃癌细胞增殖及迁移,其可能通过促进SUCLs表达以及上调琥珀酰辅酶A水平并进一步促进胃癌细胞蛋白质琥珀酰化实现。

琥珀酸脱氢酶或琥珀酰辅酶A合成酶缺失促进大肠杆菌积累5-氨基乙酰丙酸

5-氨基乙酰丙酸(ALA)是生物体内四吡咯类化合物的合成前体,在农业及医药领域应用广泛,是极具开发价值的高附加值生物基化学品。目前利用外源C4途径的重组大肠杆菌发酵生产ALA的研究主要利用LB培养基并添加葡萄糖和琥珀酸、甘氨酸等合成前体,成本较高。琥珀酸在C4途径中以琥珀酰辅酶A的形式直接参与ALA的合成。文中在以葡萄糖为主要碳源的无机盐培养基中研究了琥珀酰辅酶A下游代谢途径琥珀酸脱氢酶编码基因sdhAB和琥珀酰辅酶A合成酶编码基因sucCD缺失对ALA积累的影响。与仅表达异源ALA合成酶的对照菌株相比,sdhAB和sucCD缺失菌株ALA的产量分别提高了25.59%和12.40%,且ALA的积累不依赖于琥珀酸的添加和LB培养基的使用,从而大幅降低了生产成本,显示出良好的工业应用前景。

基于辅酶调控产9α-OH-AD工程菌株构建及其发酵工艺优化

利用偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)MFT降解植物甾醇生产9α-羟基-雄烯二酮(9α-OH-AD)过程中,存在丙酰辅酶A过量积累及辅因子不平衡等问题,影响菌株的转化效率。通过表达scpC降低胞内丙酰辅酶A含量,并通过串联表达ndh解决植物甾醇侧链降解过程中胞内辅因子I不平衡的问题,在此基础上表达AarC将琥珀酰辅酶A和乙酸盐转化为琥珀酸盐和乙酰辅酶A,增强三羟酸(TCA)循环。构建的重组工程菌株MFT-scpC-AarC-ndh经初步优化发酵后,9α-OH-AD产率达到89.56%,比原始菌株转化率提高了37.86%。本研究为9α-OH-AD的工业化生产提供了理论基础和技术支持,也为其他植物甾醇转化工程菌株的构建提供新策略。

琥珀酰辅酶A转移酶SCOT在肿瘤代谢中的研究进展

近年来,酮体代谢在肿瘤生长、侵袭、转移过程中的作用备受关注。琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)是酮体代谢的关键酶。其作用是将琥珀酰辅酶A的辅酶A基团转移至乙酰乙酸从而催化乙酰乙酰辅酶A的形成,是酮体代谢的第一个限速步骤,随后乙酰乙酰辅酶A进一步断裂成两分子的乙酰辅酶A进入三羧酸循环。研究表明SCOT在多种肿瘤中显著高表达,与肿瘤进展及患者预后密切相关,这使SCOT可作为临床诊断及预后评估的潜在标志物;另外,抑制SCOT活性可使肿瘤细胞酮体代谢受阻,即减少ATP产生,进而抑制肿瘤生长、增殖、侵袭与转移。探讨SCOT在代谢途径中的重要作用以及与肿瘤发生发展的关系,为发掘肿瘤代谢靶向分子药物提供新的思路。

猫爪草提取物对结核分枝杆菌临床分离株的可能作用靶标

利用双向电泳技术,对猫爪草提取物作用前后的结核分枝杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析,发现其中22个蛋白质斑点的浓度具有差异,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术,对其中4个表达明显下调和1个明显上调的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得5个明确的肽质量指纹图谱.通过数据库检索,确定这5个蛋白质分别为S-腺苷甲硫氨酸合成酶、吲哚-3-甘油磷酸合酶、烯酰-CoA水合酶、琥珀酰辅酶A合成酶和60 kD的分子伴侣2.其中前4个分子是首次报道参与结核分枝杆菌的重要生理活动.该结果有助于了解猫爪草提取物对结核分枝杆菌生理的影响,为进一步确定中药猫爪草提取物对结核分枝杆菌的作用靶标和机理提供了基础.

MRE11A基因多态性与心肌梗死的相关性研究

目的研究中国南方汉族人群中DNA损伤和修复因子基因多态性与心肌梗死发病风险的相关性。方法对207例经冠状动脉造影确诊心肌梗死患者和202例健康对照组的5个基因多态性进行检测,比较不同基因型和等位基因与心肌梗死患病风险的关系。结果在这5个与DNA损伤和修复密切相关的因子(减数分裂重组11同源物A、活性氧调节因子1、白介素-10、脆性组氨酸三联体基因和琥珀酰-戊二酸辅酶A转移酶)中,位于减数分裂重组11同源物A(MRE11A)基因的rs2155209多态性在心肌梗死组与对照组间差异有统计学意义,其等位基因和基因型的分布频率符合Hardy-Weinberg平衡(Х^(2)=0.255,P>0.05)。心肌梗死组rs2155209C等位基因频率高于对照组(24.9%vs 15.6%,P=0.02),logistic回归分析发现MRE11A rs2155209CC+CT基因型携带者患心肌梗死的风险高于TT基因型携带者(0R=2.01,95%CI:1.33~3.05,P=0.001),且这一关系独立于性别、年龄、吸烟、高血压、糖尿病及血清总胆固醇(total cholestero,TC)、低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein,LDL-C)水平等危险因素之外。没有证据表明其余SNPs与冠心病易感性相关。结论MRE11A基因rs2155209多态性可能是中国南方汉族人群心肌梗死发病的遗传危险因素之一。