3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症临床特点及基因变异分析

目的了解3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症的临床特点及基因变异情况。方法分析6例3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症患儿的临床资料及基因检测结果。结果6例患儿,男性3例,女性3例。1例家族史阳性。3例患儿当地医院行新生儿筛查提示该疾病,2例患儿为发病后临床诊断,1例患儿至今未发病。5例患儿发病年龄10天~5岁。初诊年龄为1个月~7岁,发病时均有不同程度的代谢危象、低血糖和高乳酸血症等表现。2例患儿死亡。血串联质谱显示3-羟基异戊酰肉碱升高,部分患儿伴有己二酰肉碱升高;尿有机酸分析提示3-羟基-3-甲基戊二酸显著升高,伴3-甲基戊烯二酸、3-羟基异戊酸等增高。4例患儿基因检测均发现HMGCL基因变异:2例c.122G>A(p.R41Q)纯合;1例c.697C>T(p.H233Y)纯合;1例c.145-2A>G和c.590G>A(p.C197Y)复合杂合。其中,c.697C>T(p.H 233Y)、c.145-2A>G和c.590G>A(p.C 197Y)变异均为首次报道,蛋白结构预测均为可能有害,ACMG评级为可能致病。另2例患儿未行基因检测。结论3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症临床表型多样,结合血串联质谱、尿有机酸分析及基因诊断可确诊。对3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症的筛查有助于早期确诊及合理治疗。

琥珀酰辅酶A转移酶的表达纯化及抗体制备

目的:琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)是酮体代谢过程中的关键限速酶,此酶缺陷多由SCOT基因突变引起,患者多有酮症酸中毒表现。为了进一步研究SCOT的功能,采用原核表达系统表达并纯化重组SCOT,制备SCOT多克隆抗体。方法:选择蛋鸡、肉鸡模式生物为研究对象,通过生物信息学对其抗原性和属间同源性进行分析,通过RT-PCR从鸡的骨骼肌cDNA中扩增了SCOT基因N端半长片段,克隆到表达载体pET28b中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组SCOT;用纯化的重组SCOT免疫小鼠后得到多克隆抗体。结果:Western印迹表明,制备的SCOT抗体具有较高的特异性,可特异性识别鸡的SCOT蛋白,同时可特异性识别小鼠和人的相应SCOT蛋白。结论:SCOT多克隆抗体的制备为后续在鸡、鼠和人中研究SCOT基因提供基础。

琥珀酰辅酶A转移酶硝基化酪氨酸位点特异单克隆抗体的制备

线粒体琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)含有4个酪氨酸残基,其4、76位点酪氨酸(Tyr4、Tyr76)的硝基化可导致其酶活性下降,制备特定的抗体可对其硝基化水平和位点进行检测。应用淋巴细胞杂交瘤技术,以化学合成的含琥珀酰辅酶A转移酶硝基化Tyr4和Tyr76肽段为半抗原,偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)后,作为免疫原免疫Balb/c小鼠,分离免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了多株融合细胞。经对融合细胞多次筛选和检测,最终获得4株单克隆抗体,分别对应SCOT Tyr4和Tyr76硝基化后表位,其间接ELISA检测效价分别达到1∶128 000、1∶32 000、1∶512 000和1∶4 096 000,表明抗体具有较强特异性和灵敏度。

大肠杆菌中高丝氨酸琥珀酰基转移酶的同源模建与对接研究

利用同源模建和分子动力学模拟方法,模建了大肠杆菌中高丝氨酸琥珀酰基转移酶的三维结构.分析了活性位点的组成,从结构上佐证了Cys142而不是Lys47为亲核进攻的残基,并通过与其天然底物琥珀酰-辅酶A的对接研究,从理论上确认了对复合物形成起到重要作用的氨基酸残基.

乙酰辅酶A:胆固醇乙酰转移酶基因单核苷酸多态性与散发性阿尔茨海默病的相关性研究

目的此实验旨在探讨ACAT1的基因甾醇氧-乙酰转移酶(sterol O-acyltransferase,SOAT1)的单核苷酸多态性位点rs1044925与散发性AD(SAD)是否具有相关性.方法在中国北方汉族人群中收集了SAD 107例,以及性别和年龄与之相匹配的同一地区健康对照者118例,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测了SOAT1多态性位点rs1044925的基因型以及载脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)的基因型.结果rs1044925位点在SAD组的基因型(AA,AC,CC)频率分别为82.2%,16.8%,1.0%,在对照组的基因型频率分别为81.4%,17.8%,0.8%,两组间基因型频率差异无显著性(P=1.000,x2=0.030,OR=0.863,95%CI=0.478～1.857).SAD组等位基因(A,C)频率分别为90.7%、9.3%,对照组等位基因频率分别为90.3%、9.7%,两组间等位基因频率差异亦无显著性(P=1.000,χ2=0.021,OR=0.885,95%CI=0.508～1.774).当数据用ApoEε4分层后,rs1044925位点基因型频率和等位基因频率两组间差异仍无显著性(P＞0.05).结论研究表明在中国北方汉族人群中ACAT1的基因SOAT1多态性位点rs1044925与SAD无相关性,SOAT1可能不是SAD的遗传易感基因.

琥珀酸脱氢酶或琥珀酰辅酶A合成酶缺失促进大肠杆菌积累5-氨基乙酰丙酸

5-氨基乙酰丙酸(ALA)是生物体内四吡咯类化合物的合成前体,在农业及医药领域应用广泛,是极具开发价值的高附加值生物基化学品。目前利用外源C4途径的重组大肠杆菌发酵生产ALA的研究主要利用LB培养基并添加葡萄糖和琥珀酸、甘氨酸等合成前体,成本较高。琥珀酸在C4途径中以琥珀酰辅酶A的形式直接参与ALA的合成。文中在以葡萄糖为主要碳源的无机盐培养基中研究了琥珀酰辅酶A下游代谢途径琥珀酸脱氢酶编码基因sdhAB和琥珀酰辅酶A合成酶编码基因sucCD缺失对ALA积累的影响。与仅表达异源ALA合成酶的对照菌株相比,sdhAB和sucCD缺失菌株ALA的产量分别提高了25.59%和12.40%,且ALA的积累不依赖于琥珀酸的添加和LB培养基的使用,从而大幅降低了生产成本,显示出良好的工业应用前景。

琥珀酰辅酶A转移酶SCOT在肿瘤代谢中的研究进展

近年来,酮体代谢在肿瘤生长、侵袭、转移过程中的作用备受关注。琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)是酮体代谢的关键酶。其作用是将琥珀酰辅酶A的辅酶A基团转移至乙酰乙酸从而催化乙酰乙酰辅酶A的形成,是酮体代谢的第一个限速步骤,随后乙酰乙酰辅酶A进一步断裂成两分子的乙酰辅酶A进入三羧酸循环。研究表明SCOT在多种肿瘤中显著高表达,与肿瘤进展及患者预后密切相关,这使SCOT可作为临床诊断及预后评估的潜在标志物;另外,抑制SCOT活性可使肿瘤细胞酮体代谢受阻,即减少ATP产生,进而抑制肿瘤生长、增殖、侵袭与转移。探讨SCOT在代谢途径中的重要作用以及与肿瘤发生发展的关系,为发掘肿瘤代谢靶向分子药物提供新的思路。

蓝桉叶片桉叶素生物合成机理研究

为探明蓝桉(Eucalyptus globulus Labill.)叶片桉叶素合成过程中关键酶活性与桉叶素含量的关系,以不同发育阶段的蓝桉叶片为研究对象,测定桉叶素相对含量和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPI)、香叶基焦磷酸合酶(GPPS)、桉叶素合酶(CinS)活性,并对其进行方差分析、相关性分析、通径分析.结果表明,随着蓝桉叶片成熟度增加,桉叶素相对含量逐渐增加,HMGR、DXS、GPPS、IPPI的酶活性逐渐下降.在一个完整的年生长周期内,桉叶素相对含量在7月份显著高于其余月份,HMGR、DXS、GPPS、CinS活性在5、6月份显著高于其余月份.桉叶素相对含量与DXS、CinS活性显著正相关,与HMGR、IPPI、GPPS酶活性极显著负相关.研究结果表明,在5、6月份增强蓝桉幼嫩叶片的DXS和CinS活性,可以有效提高桉叶素积累,进而提高蓝桉桉叶油的产量和品质.

棉花甲基化酶基因COMT和CCoAOMT的组织特异性表达分析

本研究利用半定量RT-PCR分析方法探索了陆地棉(Gossypium hirsutum L.)木质素合成途径中甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在不同组织和不同发育时期纤维中的表达情况。结果表明COMT1,COMT2,COMT3和CCoAOMT1,CCoAOMT2在棉花的7个组织器官(根、茎、叶、子叶、花瓣、雄蕊、胚珠)中都有表达,其中COMT1和CCoAOMT1在各组织中的表达趋势类似,COMT2,COMT3和CCoAOMT2表达趋势各异。在5～25d的棉纤维发育过程中,COMT1和COMT3表达稳定,COMT2表达量逐渐增加。而CCoAOMT基因家族的2个基因的表达量变化相对明显,CCoAOMT1在25d出现表达高峰,CCoAOMT2则在10d和15d呈现高表达量。本研究表明甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在棉花的根,茎等维管组织中具有相对一致的高表达量,而在其他组织和发育纤维中则呈现出明显的组织特异性和纤维发育时期特异性。

白介素-1对单核细胞向泡沫细胞分化过程中ACAT-1蛋白表达和活性的影响

目的探讨白介素-1（IL-1）对单核细胞向泡沫细胞分化过程中脂酰辅酶A-胆固醇酰基转移酶-1（ACAT-1）蛋白表达和活性的影响。方法200nmol／L佛波酯（PMA）诱导THP-1单核细胞48h使其转化为巨噬细胞，流式细胞术检测CDl4的表达；巨噬细胞与80mg／L氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）共孵育24h，使之向泡沫细胞分化，油红O染色观察细胞质内脂质沉积；Westernblot检测各组细胞（单核细胞组、巨噬细胞组、泡沫细胞组、泡沫细胞＋IL-1组、泡沫细胞＋IL-1／Anti-ILl组）ACAT-l的蛋白表达，液相闪烁计数法检测ACAT-1的酶活性。结果单核细胞株THP-1与200nM的PMA共孵育48h后，分化为巨噬细胞，CDld阳性表达率为85．7％；巨噬细胞与Ox-LDL共孵育24h后，油红O染色胞浆内可见大量吞噬的脂质小滴。与单核细胞组相比，巨噬细胞组、泡沫细胞组和泡沫细胞＋IL-1组ACAT-1蛋白表达上调，活性升高（P〈0．05），泡沫细胞＋IL-1／Anti-ILl组蛋白表达上调及活性升高不明显（P〉0．05）。结论IL-1对单核细胞向泡沫细胞分化过程中ACAT-1蛋白表达及酶活性有上调作用，IL-1单克隆抗体可以拮抗这种效应。

葱白提取物对非酒精性脂肪肝模型大鼠ACCase和CPT-1表达的影响

目的:探讨葱白提取物治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)可能的作用机制。方法:60只大鼠分为正常组、模型组、低剂量葱白组、中剂量葱白组、高剂量葱白组、易善复组,每组10只。采用高脂饮食造模,造模10周后经组织病理学鉴定模型制备成功后给予不同剂量药物干预4周。光镜下观察肝组织HE染色组织结构;检测血浆黏度、全血黏度及血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平及肝组织游离脂肪酸(FFA)的含量;Realtime PCR检测大鼠肝脏乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、肉毒碱棕榈酰基转移酶-1(CPT-1)mRNA的表达情况。结果:模型组大鼠肝脏出现明显脂肪变性,舌像评分、肝指数、血浆黏度和全血黏度以及血清AST、ALT、TC、TG水平明显升高(P<0.05),ACCase mRNA表达升高(P<0.05),CPT-1 mRNA的表达下降(P<0.05);低、中、高剂量葱白组及易善复组肝脂肪变性减轻,舌像评分、肝指数、血浆黏度和全血黏度以及血清AST、ALT、TC、TG水平降低(P<0.05),以高剂量葱白组和易善复组下降明显,高剂量葱白组和易善复组差异无统计学意义(P> 0.05)。结论:葱白提取物治疗NAFLD有效,其机制与促进CPT-1表达及降低ACCase表达有关。

脂肪酸代谢酶在坏死型高脂血症性急性胰腺炎大鼠肝脏组织中的表达及意义

目的:动态观察脂肪酸代谢及转移酶(SCD-1、CPT-Ⅰ和CD36)在坏死型高脂血症性急性胰腺炎(HLP)大鼠肝脏组织中的表达并探讨其意义。方法:采用胰管内注射5%牛磺胆酸钠诱导高脂血症大鼠产生坏死型HLP大鼠模型。制模后第6、12、24h分别处死大鼠,每组6只大鼠。对照组仅建立坏死型急性胰腺炎大鼠模型。测定血清淀粉酶和胰腺组织病理学评分观察大鼠胰腺组织炎症程度。RT-PCR检测肝脏组织SCD-1、CPT-Ⅰ和CD36mRNA表达;免疫组化检测肝脏组织SCD-1蛋白表达。结果:HLP组大鼠血清淀粉酶水平低于对照组;病理学评分示HLP组大鼠急性胰腺炎程度加重。RT-PCR和免疫组化分析示HLP组大鼠肝脏组织中SCD-1mRNA和蛋白表达显著低于对照组;RT-PCR检测示HLP组大鼠肝脏组织中CPT-Ⅰ和CD36mRNA表达略高于对照组。结论:HLP大鼠肝脏脂肪酸代谢及转移酶异常表达,加重了肝脏组织细胞内外的脂质代谢紊乱,是加重坏死型急性胰腺炎胰腺组织损伤的重要机制之一。

腺苷酸激活蛋白激酶磷酸化障碍导致烧伤后骨骼肌脂质沉积的实验研究

目的探讨影响腺苷酸激活蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)/乙酰辅酶a羧化酶(acetyl Co A carboxylase,ACC)信号通路导致烧伤后骨骼肌脂质沉积(intramyocellular lipids,IMCLs)的分子机制。方法采用30%体表面积Ⅲ度烧伤小鼠模型,将54只BALB/c小鼠按随机数字表法分为正常对照组、AMPK激活剂(acadesine,AICAR)组、烧伤组、烧伤+AICAR组,同位素标记法检测各组小鼠腓肠肌中肉碱脂酰转移酶-1(carnitine palmitoyl transferase-1,CPT1)活性变化,Western blot检测各组小鼠腓肠肌中AMPK-α、p-AMPK-α、ACC及p-ACC表达水平,通过油红O染色和甘油三酯(triglyceride,TG)测定法评估各组小鼠腓肠肌IMCLs情况。结果烧伤后小鼠腓肠肌中ACC表达量较伤前显著升高(P<0.05),而AMPK-α、p-AMPK-α、p-ACC以及CPT1活性均显著降低(P<0.05)。在AICAR作用下,正常小鼠腓肠肌中p-AMPK-α表达显著升高[(1.16±0.08)vs(2.38±0.22),P<0.05],p-ACC表达显著升高[(1.74±0.10)vs(3.72±0.18),P<0.05],CPT1活性显著升高[(2.95±0.39)nmol/(min·mg)vs(6.35±0.68)nmol/(min·mg),P<0.05],TG含量显著降低[(3.88±0.40)mmol/g vs(2.89±0.54)mmol/g,P<0.05]。烧伤+AICAR组小鼠腓肠肌中p-AMPK-α、p-ACC、CPT1活性及甘油三酯含量较烧伤组无显著差异(P>0.05)。正常对照组和AICAR组正常小鼠腓肠肌组织切片油红O染色未见明显脂质沉积,而烧伤组和烧伤+AICAR组烧伤小鼠腓肠肌组织切片油红O染色均显示有大量脂质沉积,两组间并无显著差异(P>0.05)。结论骨骼肌中AMPK磷酸化障碍是烧伤后IMCLs的重要分子机制之一。

HMGCS1表达对食管鳞癌细胞转移能力及食管鳞癌患者预后的影响

目的:探讨3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶1(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 1,HMGCS1)在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)及食管鳞癌肺转移患者中表达的临床意义及其对食管鳞癌细胞转移能力的影响。方法:通过收集南京医科大学附属淮安第一医院6例食管鳞癌手术患者组织样本,根据其随访最终信息分为未转移组和肺转移组,对两组样本进行蛋白质谱测序分析,筛选差异表达的蛋白质HMGCS1,通过GEPIA数据库进行验证。Western blot及qPCR检测食管上皮细胞及ESCC癌细胞中HMGCS1表达水平。免疫组织化学方法对121例随访信息完善的食管鳞癌患者组织芯片进行染色,检测HMGCS1表达。采用Cox生存风险比例模型分析ESCC患者生存的风险因素,同时采用多变量相关性分析HMGCS1与ESCC患者临床病理之间的关系,采用Kaplan-Meier法分析HMGCS1对ESCC患者预后的影响。构建HMGCS1过表达质粒转染食管鳞癌细胞,利用划痕及Transwell检测细胞的迁移及侵袭能力。结果:与未发生转移的食管鳞癌患者癌组织相比,肺转移患者肿瘤组织中有51种蛋白下调,45种蛋白上调,其中HMGCS1在肺转移患者食管鳞癌组织中的表达显著低于未转移患者。GEPIA数据显示HMGCS1在食管鳞癌中表达也是下调的。Western blot及qPCR结果表明食管鳞癌细胞中HMGCS1表达显著低于正常食管上皮细胞。121例食管鳞癌患者组织芯片免疫组织化学染色结果证实,HMGCS1在食管鳞癌中的表达显著低于正常食管组织,且有淋巴结转移的患者其表达显著低于无淋巴结转移患者(P <0.05)。Cox生存风险分析显示,T分期[HR:2.118(1.020~4.399)]、淋巴结转移[HR:2.127(1.466~5.584)]、HMGCS1低表达[HR:0.413(0.211~0.807)]是食管鳞癌患者的生存风险因素。多变量相关性分析则显示,HMGCS1表达与淋巴结转移显著相关。Kaplan-Meier生存分析显示,HMGCS1低表达患者预后较差。食管鳞癌细胞过表达HMGCS1后,ESCC细胞的迁移及侵袭能力显著降低(P <0.05)。结论:HMGCS1能够抑制ESCC细胞的转移能力,其表达与ESCC患者预后呈正相关。

3-(4-羟基苯基)丙酸在酿酒酵母中的生物合成

3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA)是一种芳香类化合物,作为中间体主要应用于医药、食品、化学领域,具有重要的经济价值。旨在实现HPPA在酿酒酵母中的从头合成,通过在酿酒酵母中过表达约氏黄杆菌来源的酪氨酸转移酶(Fj TAL)、拟南芥来源的对香豆酰辅酶A连接酶(At4CL),同时利用酿酒酵母BY4742自身来源的超长链烯酰辅酶A还原酶(Sc TSC13)、硫酯水解酶,实现了在酿酒酵母中从头合成HPPA,产量约为70 mg/L左右。在以4 mmol/L酪氨酸为前体、半乳糖诱导Fj TAL过表达、30℃发酵培养72 h的条件下,约36%的酪氨酸转化生成对香豆酸;在以4 mmol/L对香豆酸或咖啡酸为前体,半乳糖诱导At4CL过表达,同时利用酵母内源Sc TSC13、硫酯水解酶,30℃发酵培养72 h的条件下,约94%的对香豆酸被还原成HPPA,约91%的咖啡酸被还原成3,4-二羟基苯丙酸(DHPPA),为进一步生物合成HPPA及其衍生物奠定了基础。

猫爪草提取物对结核分枝杆菌临床分离株的可能作用靶标

利用双向电泳技术,对猫爪草提取物作用前后的结核分枝杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析,发现其中22个蛋白质斑点的浓度具有差异,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术,对其中4个表达明显下调和1个明显上调的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得5个明确的肽质量指纹图谱.通过数据库检索,确定这5个蛋白质分别为S-腺苷甲硫氨酸合成酶、吲哚-3-甘油磷酸合酶、烯酰-CoA水合酶、琥珀酰辅酶A合成酶和60 kD的分子伴侣2.其中前4个分子是首次报道参与结核分枝杆菌的重要生理活动.该结果有助于了解猫爪草提取物对结核分枝杆菌生理的影响,为进一步确定中药猫爪草提取物对结核分枝杆菌的作用靶标和机理提供了基础.

何首乌二苯乙烯苷降血脂作用机理研究

目的:探讨何首乌二苯乙烯苷(TSG)调节胆固醇代谢作用机制。方法:体外培养Bel-7402细胞株,待细胞长满80%后无血清培养基饥饿细胞24h,分别加入1、10、100μM的二苯乙烯苷及10μM的阿托伐他汀,RT-PCR检测给药24h后细胞内低密度脂蛋白受体(LDLR)、β-羟β-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)、胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)、酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)的基因表达。结果:和空白对照组相比,二苯乙烯苷组能明显升高肝细胞表面LDLR的表达(P<0.05,P<0.01),二苯乙烯苷中、高剂量组与阳性药组相比无明显差异(P>0.05);二苯乙烯苷组与阳性药组均增加细胞HMGCOAR表达,各组之间无明显差异;阿托伐他汀组降低ACAT的表达(P<0.05),二苯乙烯苷组则无明显作用;阿托伐他汀组Cyp7A1表达高于二苯乙烯苷组,与对照组相比无显著性差异。结论:二苯乙烯苷可能是通过抑制细胞内胆固醇的合成及升高低密度脂蛋白受体的表达而起到降血脂作用。

迟发型3-羟基-3-甲基戊二酸尿症导致脑白质病

3-羟基-3-甲基戊二酸尿症是一种罕见的有机酸代谢病,病因为常染色体隐性遗传所导致的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺陷。患者通常在新生儿期至婴幼儿期发病。本研究报告1例晚发型3-羟基3-甲基戊二酸尿症导致的脑白质病。患儿为7岁男孩,急性起病,表现为头痛、困倦、呕吐,进行性加重,一般化验发现肝损害、酮症、白细胞减少,脑磁共振扫描示双侧脑白质对称弥漫性病变。血液羟异戊酰肉碱、乙酰肉碱显著增高。尿液3-羟基-3-甲基戊二酸显著增高,3-甲基戊烯二酸、3-羟基戊二酸、甲基巴豆酰甘氨酸增高。经静脉滴注葡萄糖和左旋肉碱症状缓解。维持治疗半年后复诊,尿3-羟基3-甲基戊二酸降低,全身情况良好。

PRMT1结合并增强HMGCR活性对食管鳞癌细胞增殖能力的影响

目的探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)结合羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)后活性变化及其对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。方法以食管鳞癌ECA109细胞为模型,通过免疫共沉淀法观察PRMT1与HMGCR在细胞中的相互结合作用。将ECA109细胞随机分为感染组和对照组,分别以表达特异性针对PRMT1的RNA干扰分子的慢病毒质粒转染48 h,采用Western blot法分别检测PRMT1、HMGCR蛋白及甲基化HMGCR蛋白,分光光度法检测HMGCR酶活性,CCK-8法检测细胞增殖活性。结果细胞裂解后的蛋白共沉淀复合物分别用抗PRMT1、HMGCR抗体捕获后,可检测到HMGCR、PRMT1蛋白条带。感染组和对照组ECA109细胞中PRMT1蛋白相对表达量分别为0.057±0.011和0.239±0.041(P<0.01),HMGCR蛋白相对表达量分别为0.175±0.031和0.184±-0.037(P>0.05)。感染组和对照组ECA109细胞甲基化HMGCR蛋白相对表达量分别为0.028±0.006、0.107±0.016,HMGCR相对活性分别为0.104±0.009、0.277±0.013,P均<0.01。感染组ECA109细胞培养24 h后,细胞增殖的OD_(450)值已低于对照组(P<0.05);培养48 h及72 h后,两组OD_(450)值差距进一步扩大(P均<0.01)。结论 PRMT1可通过结合HMGCR蛋白促进其甲基化途径增强HMGCR蛋白活性,进而促进食管鳞癌细胞的体外增殖能力。

五节芒CCoAOMT和4CL的克隆和表达分析

木质素是细胞壁的重要组成部分,在植物的生长发育和抵御病原微生物的侵害方面发挥着重要的作用,但木质素结构稳定,成为生物质能源转化的障碍。以五节芒(Miscanthus floridulus)为材料克隆得到了木质素合成过程中的关键酶CCoAOMT基因全长CDS序列和4CL基因的CDS半长序列,并对其CDS和氨基酸序列与其他物种进行了比对分析。相应的qRT-PCR分析显示,2个基因在五节芒的幼苗期、抽穗期的茎节、成熟叶片、幼穗都有表达,且与木质素的合成有一定的相关性。间苯三酚溶液染色结果亦显示,2个基因的表达规律与茎秆的木质化进程一致。五节芒CCoAOMT和4CL基因的克隆和表达分析将为进一步研究其生物学功能和改良能源作物奠定基础。