产琥珀酸丝状杆菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

为实现瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因（FsGLU）的高效表达,开发新的饲用β-葡聚糖酶资源,根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、G＋C含量等特点,对FsGLU基因进行密码子优化,然后合成优化后的1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因（FsGLUm）,转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达并对重组FsGLUm的酶学特性、底物特异性和对消化酶的耐受性进行了研究。结果表明：摇瓶水平条件下,以甲醇诱导表达48 h时,重组FsGLUm酶活性提高25.1%（P〈0.05）。在10 L发酵罐中诱导96 h后,重组FsGLUm的活性为6 424 U·mL-1,菌体湿质量和干质量达到274.6和123.6 g·L-1。酶学特性分析表明：纯化后的重组FsGLUm最适反应温度为37℃,最适反应pH值为5.0,比活性为10 397 U·mg-1。在温度低于37℃、pH 5.0~6.5时该酶具有较好的稳定性。底物特异性分析表明：重组FsGLUm可水解大麦β-葡聚糖和地衣多糖,不降解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和羧甲基纤维素钠。在胃蛋白酶和胰蛋白酶共同作用60 min后,仍保留了50.5%的酶活性。结论：FsGLU基因在毕赤酵母GS115中实现了高效表达,重组FsGLUm作为饲用酶制剂具有潜在的应用价值。

实时荧光定量PCR检测产琥珀酸丝状杆菌数量方法的研究

为建立产琥珀酸丝状杆菌定性定量研究方法,实现后期该菌种用于纤维素生物可再生能源等方面应用研究。本试验提取15份瘤胃细菌脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA),利用SYBR Premix Ex Taq荧光染料嵌合法和人工合成基因技术,采用实时荧光定量PCR方法检测样品中产琥珀酸丝状杆菌数量;结果:所构建的质粒DNA标准曲线线性关系良好,R2=1,所有样品溶解曲线均为单峰,扩增曲线呈S型,扩增效率为93.9%。表明应用构建实时荧光定量PCR法可对实际样品中产琥珀酸丝状杆菌进行定性定量研究。

产琥珀酸丝状杆菌内切葡聚糖酶end-1基因密码子偏好性分析

产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)end-1基因表达的内切葡聚糖酶是能够降解纤维素的纤维素复合酶中的一种。利用Codon W、CUSP和CHIPS等相关软件分析产琥珀酸丝状杆菌内切葡聚糖酶end-1基因的密码子使用情况,比较end-1基因与大肠杆菌、酿酒酵母菌、枯草芽胞杆菌以及乳酸乳球菌的密码子偏好性。结果表明,内切葡聚糖酶end-1基因偏好使用G/C结尾的密码子,其中有25种偏好密码子(RSCU值大于1),偏好性较强的有GCT、TGC、GAA、GGT、CAC、ATC、CTC、CCG、CGT、TCC和TAC(RSCU值均大于或等于2);end-1基因的密码子偏好性与4个宿主的基因组密码子偏好性差异较大,其中与乳酸乳球菌的密码子偏好性差异最大。若使该基因在上述几种表达系统中得到较高水平的表达,则需要对其密码子进行优化。

瘤胃中产琥珀酸丝状杆菌的纤维素降解机制及其在秸秆饲料化中的应用

我国是农作物秸秆生产大国,农作物秸秆资源饲料化有助于缓解我国畜牧业饲料原料不足和秸秆类废弃物污染问题。秸秆中纤维素含量约为30%~40%,致使动物对秸秆消化速率减慢,成为秸秆饲料化的难点。动物瘤胃中分离的产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)能够高效降解纤维素,其采用不同于游离纤维素酶降解机制和纤维小体降解机制的第三种纤维素降解机制。文章综述了产琥珀酸丝状杆菌纤维素降解机制的研究进展,为产琥珀酸丝状杆菌在秸秆饲料化中的应用提供参考。

琥珀酸丝状杆菌RT-PCR方法的建立

[目的]了解牛瘤胃内微生物的变化。[方法]以琥珀酸丝状杆菌为对象,根据16S rRNA序列分别设计引物。从牛瘤胃液提取总DNA,扩增琥珀酸丝状杆菌的DNA片段,并连接在pDM-18T载体上,经PCR和测序鉴定后,以不同稀释度的重组质粒为模版进行RT-PCR。[结果]扩增的目的片段与已知的菌种相应片段的同源性为100%。以不同稀释度的重组pMD-18T为模板建立的RT-PCR扩增曲线有明显差异,绘制标准曲线的相关系数接近1,熔解曲线呈单一峰值。[结论]成功建立了琥珀酸丝状杆菌的实时荧光定量PCR方法,为进一步研究瘤胃内微生物变化奠定基础。

纤维素结合域的酿酒酵母表面展示及其黏附位点初探

利用酿酒酵母表面展示系统表达产琥珀酸丝状杆菌S85纤维素结合域家族2(CBD2),分析其纤维黏附位点。将CBD2基因插入质粒pYD1的AGA2 3′端,构建pMCBD2重组质粒,化学转化pMCBD2至酿酒酵母EBY100中,2%半乳糖诱导CBD2表达于酿酒酵母表面。利用免疫组化技术检测重组酵母细胞在稻草茎细胞壁上的黏附位点。结果表明:利用酿酒酵母表面展示系统可成功表达产琥珀酸丝状杆菌S85的CBD2基因;重组CBD2的pMCBD2-EBY100与稻草茎孵育后,经抗V5异硫氰酸荧光素标记抗体处理可在稻草茎的薄壁、厚壁和维管组织均检测到荧光。产琥珀酸丝状杆菌S85的CBD2黏附稻草多个组织。结果提示:酿酒酵母表面展示技术与免疫组化技术联用研究瘤胃细菌CBD的黏附位点是可行的。

毕赤酵母不同甲醇利用表型Mut^+和Mut^s表达FsGLUm基因的比较

将来源于产琥珀酸丝状杆菌的β-葡聚糖酶基因根据毕赤酵母的偏好性进行密码子优化,通过全基因合成该优化基因(Fs GLUm)并构建重组表达载体p PIC9K-Fs GLUm。将p PIC9K-Fs GLUm分别用SalⅠ和BglⅡ酶切线性化后电击转化入毕赤酵母GS115染色体DNA中,经过表型筛选和抗性筛选获得不同甲醇利用表型Mut+和Muts阳性菌株。经刚果红平板检测,在摇瓶水平下,Mut+型菌株表达产物产生的水解透明圈明显大于Muts型菌株表达产物。在发酵罐水平下,Mut+型菌株各时间段表达产物酶活性明显高于Muts型菌株。Mut+型菌株表达的酶活性在甲醇诱导96h达到最大值,为6424U/m L,比活性为2607U/mg,菌体干重为123.6g/L。Muts型菌株表达的酶活性在诱导后108h达到最大值,为119U/m L,比活性为1867U/mg,菌体干重为113.5g/L。以上结果表明,Mut+型毕赤酵母更有利于产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的表达。