同型半胱氨酸通过促进细胞焦亡和上调琥珀酸脱氢酶亚基A诱导神经炎症反应

目的探索同型半胱氨酸(Hcy)是否通过促进细胞焦亡和上调琥珀酸脱氢酶亚基A(SDHA)蛋白表达诱导神经炎症反应。方法使用不同浓度Hcy(1.25、2.50、5.00 mmol/L)处理小鼠海马神经元细胞系HT22细胞。CCK-8检测细胞活力;免疫荧光法观察细胞形态和焦亡相关蛋白消皮素(GSDMD)与细胞膜的共定位情况;Western blotting检测细胞核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3(NLRP3)、天冬氨酸蛋白水解酶-1前体(pro-Caspase-1)和Caspase-1的活性片段(cleaved-Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、GSDMD和GSDMD的N端结构域(GSDMD-N)等焦亡相关蛋白及SDHA蛋白表达水平。酶联免疫吸附测定法检测炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)水平。结果Hcy可显著降低HT22细胞活力,损伤HT22细胞突触,增加GSDMD与细胞膜的共定位和细胞膜破裂程度,上调HT22细胞NLRP3、pro-Caspase-1、cleaved-Caspase-1、ASC、GSDMD和GSDMD-N等焦亡相关蛋白及SDHA蛋白表达水平,并增加IL-1β和IL-18水平。结论Hcy可诱导神经炎症反应,其机制与其促进细胞焦亡和上调SDHA蛋白表达密切相关。

琥珀酸脱氢酶B亚基对卵巢癌细胞线粒体DNA拷贝数影响的研究

目的:探讨琥珀酸脱氢酶B亚基(SDHB)对卵巢癌线粒体DNA(mtDNA)相对拷贝数的影响。方法:Real-time PCR法检测人卵巢良性肿瘤组织、卵巢癌组织中SDHB mRNA水平,检测mtDNA相对拷贝数(mtND2/HBB)和线粒体转录因子A(TFAM)水平。siRNA干扰SKOV3和A2780中SDHB表达,real-time PCR检测干扰前后mtND2/HBB、TFAM和DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs,也称作PRKDC)水平;CCK-8法检测癌细胞对顺铂的化疗耐药性。Western blot法检测p-p38和DNA损伤标记蛋白γ-H2AX蛋白水平。结果:人卵巢癌组织中SDHB表达低于卵巢良性肿瘤组织,mtND2/HBB和TFAM水平高于卵巢良性肿瘤组织。siRNA干扰SKOV3和A2780中SDHB表达后,mtND2/HBB和PRKDC显著升高,TFAM水平升高不显著。SDHB低表达显著上调p-p38蛋白水平,显著降低γ-H2AX蛋白水平。结论:SDHB在人卵巢癌组织中低表达,SDHB低表达显著增加卵巢癌细胞mtDNA相对拷贝数,提高卵巢癌细胞化疗耐药性,其机制可能与SDHB通过p38 MAPK通路影响DNA损伤修复相关。

多主棒孢SdhB-H278R突变位点AS-real-time PCR定量检测体系的建立

【目的】建立一种快速、高效、定量检测黄瓜多主棒孢(Corynespora cassiicola)琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)H278R突变的实时荧光定量PCR(AS-real-time PCR)检测方法,并进行效果验证。【方法】从北京市大兴区采集、分离纯化病原菌,获得24株多主棒孢的单孢菌株,采用菌丝生长速率法测定其对啶酰菌胺的EC50,随机选取4株敏感(S)和8株抗性(R)菌株测其菌丝生长速率、产孢量和致病性。采用引物对Cc-SdhB-F/R测定多主棒孢SdhB基因序列,检测SdhB的碱基变化。基于多主棒孢SdhB的相同核酸序列和SNP位点设计内参引物B-H278R-TY-F/R和特异性引物B-H278R-2F/2R14,建立并优化AS-real-time PCR定量检测体系,并对引物的特异性、熔解曲线和灵敏度进行评价。利用该体系分别检测含有H278R不同突变比例的DNA和孢子悬浮液。【结果】测定的24个菌株中,敏感菌株占66.7%,EC50值为0.057—0.563μg·mL^(-1);抗性菌株占33.3%,EC50值为5.395—11.710μg·mL^(-1)。抗性和敏感菌株仅在菌丝生长速率方面存在显著性差异,且菌丝生长速率与EC50之间存在显著负相关。在产孢量和致病性方面不存在显著性差异。测序分析发现抗性菌株均携带SdhB-H278R突变。本研究设计的引物B-H278R-2F和B-H278R-2F2R14特异性强,仅对多主棒孢SdhB-H278R突变菌株的DNA有扩增条带,对其余供试菌株均无条带扩增。普通AS-PCR检测的灵敏度为91 pg·μL^(-1),而AS-real-time PCR的灵敏度可达9.1 pg·μL^(-1),灵敏度为普通AS-PCR的10倍。以基因组DNA为标准品,构建的AS-real-time PCR标准曲线ΔCT值与相对模板浓度的对数有良好的线性关系,相关系数为0.9857,扩增效率为92.59%。熔解曲线吸收峰单一,内参引物B-H278R-TY-F/R和特异性引物B-H278R-2F/2R14分别在87.81℃和91.62℃处出现单一特异性峰。用DNA和孢子悬浮液对标准曲线进行验证,结果表明随着相对模板浓度逐渐降低,该检测体系的准确性逐渐升高且检测下限为5%,同时预期值与试验值呈线性相关(R^2=0.9998和R^2=0.9922)。【结论】建立了一种高效、定量、快速的AS-real-time PCR检测体系用于SdhB-H278R突变位点的检测,可为杀菌剂的抗性治理提供理论依据。

抑制线粒体复合体Ⅱ诱导线粒体自噬影响细胞增殖的研究

线粒体复合体Ⅱ,也被称为琥珀酸脱氢酶,参与线粒体呼吸作用及代谢重编程的调控过程.复合体Ⅱ由4个亚基构成,其突变与肿瘤的发生密切相关.本文探讨复合体Ⅱ与线粒体自噬调控及细胞增殖之间的关系.实验采用复合体Ⅱ的特异性抑制剂TTFA或敲除复合体Ⅱ的B亚基(SDHB)使其功能缺失.结果发现,复合体Ⅱ功能的缺失显著引起线粒体形态的片段化进而发生线粒体自噬,导致线粒体蛋白水平减少,抑制ATP生成;由于线粒体功能受到抑制,细胞葡萄糖消耗及乳酸产生水平增加,并显著抑制细胞的细胞的增殖.综上所述,复合体Ⅱ功能缺失可能通过调控线粒体自噬而影响细胞增殖,从而在肿瘤发生中起重要作用.

微小RNA-938在肝细胞癌中的表达及对肝癌细胞增殖的影响

目的探讨微小RNA-938(miR-938)在肝癌组织中的表达情况及其对肝癌细胞增殖的影响和调控机制。方法收集2015年1月至2019年6月在南通大学第二附属医院就诊并手术切除的40例肝细胞癌患者肝癌组织和癌旁组织,其中男性25例,女性15例,平均年龄61.4岁。miR-938过表达组HepG2肝癌细胞转染miR-938模拟物,阴性对照组转染阴性对照序列。采用试剂盒检测细胞增殖情况,荧光定量聚合酶链反应检测miR-938及琥珀酸脱氢酶复合体亚基D(SDHD)的表达,Western印迹检测SDHD蛋白表达。双荧光素酶报告实验验证miR-938的靶基因。结果肝癌组织中miR-938相对表达量为(0.060±0.002),高于癌旁组织(0.030±0.002),差异有统计学意义(P<0.05)。肝癌组织中SDHD mRNA相对表达量为(0.028±0.002),低于癌旁组织(0.062±0.002),SDHD蛋白相对表达为(0.963±0.008),低于癌旁组织(1.083±0.037),差异均有统计学意义(均P<0.05)。miR-938过表达组细胞增殖活力明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告结果显示只有miR-938模拟物和pGL3-SDHD野生型质粒组荧光素酶活性下降。阴性对照组SDHD mRNA和蛋白相对表达量均高于过表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-938在肝细胞癌患者肝癌组织中高表达,miR-938可能通过抑制SDHD的表达,促进肝癌细胞增殖。

低氧预处理对氧糖剥夺人脑微血管内皮细胞线粒体呼吸功能的保护作用

目的通过观察低氧预处理对氧糖剥夺人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMVEC)低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和线粒体琥珀酸脱氢酶复合体亚基2(succinate dehydrogenase complex iron sulfur subunit B,SDHB)表达水平以及线粒体ATP合成的影响,评价低氧预处理对氧糖剥夺HBMVEC的保护作用.方法离体培养HBMVEC,采用随机数字表法将HBMVEC分为5组(每组6孔):正常对照组(A组)、氧糖剥夺组(B组)、氧糖剥夺+低氧预处理组(C组)、氧糖剥夺+低氧预处理+二甲基草酰甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)组(D组)和氧糖剥夺+低氧预处理+2-ME组(E组).给予低氧预处理及HIF-1α抑制剂和稳定剂后,对HBMVEC进行氧糖剥夺,使用Annexin V检测细胞凋亡和坏死;用ATP检测试剂盒测定细胞内ATP含量;采用Western blot法测定HIF-1α、SDHB蛋白表达.结果与A组比较,B组、C组、D组和E组HIF-1α表达水平明显升高,ATP含量明显减少,细胞凋亡率明显升高(P<0.05),B组、C组和E组SDHB表达水平明显降低(P<0.05);与B组比较,C组和D组HIF-1α和SDHB表达水平明显升高,ATP含量明显增加,细胞凋亡率明显降低(P<0.05).结论低氧预处理可通过调节HIF-1α表达改善氧糖剥夺所致的HBMVEC线粒体呼吸链复合体Ⅱ的损伤,发挥对氧糖剥夺HBMVEC模型的保护作用.