甘蔗NAD(P)H脱氢酶复合体O亚基基因克隆及其与甘蔗花叶病毒VPg互作

NAD(P)H脱氢酶(NDH)复合体介导循环电子传递,对于维持叶绿体高效的光合作用具有重要作用。甘蔗(Saccharum spp. hybrid)中NDH复合体应答及参与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)的侵染尚未见报道。本研究克隆了甘蔗NDH复合体的O亚基,命名为ScNdhO,其开放读码框(open reading frame,ORF)长度为471 bp,编码长度为156 aa的蛋白。生物信息学分析表明,ScNdhO为稳定的亲水性蛋白,不存在信号肽,无跨膜结构域;蛋白二级结构元件多为无规则卷曲,具有典型的NDH复合体O亚基结构域;系统进化树分析表明,该蛋白属于NDH复合体O亚基蛋白家族。实时荧光定量 PCR分析发现,ScNdhO基因的表达具有明显的组织特异性,在成熟甘蔗叶片中的表达量最高,在茎中的表达量最低,在根中几乎不表达;ScNdhO基因在SCMV侵染早期上调表达,后期下调表达。亚细胞定位分析表明,ScNdhO定位于叶绿体。酵母双杂交(yeast two hybrid,Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)实验表明,ScNdhO与SCMV-VPg互作。推测ScNdhO被SCMV选择性利用,可能参与SCMV基因组复制及花叶病症状的产生。

琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂isofetamid的开发

作用于病原菌线粒体电子传递系统复合体Ⅱ的琥珀酸脱氢酶的杀菌剂是一类新颖的药剂,它们又称为琥珀酸脱氢酶抑制剂（Succinate Dehydrogenase Inhibitors,SDHI）.此类杀菌剂至今已开发18个化合物,按照时间将它们分为三代.第一代为20世纪60年代开发的品种有。

高通量测序揭示原发性胆汁性胆管炎患者的T细胞受体图谱特征

目的揭示原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)患者T细胞受体(T cell receptor,TCR)图谱特征,并揭示大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)的丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex E2,PDC-E2)抗原在PBC疾病的分子模拟机制。方法采用多重聚合酶链反应和免疫组库测序技术分析PBC患者和健康对照者的CD4^(+)和CD8^(+)记忆性TCRβ链互补决定区3(complementarity determining region 3,CDR3)序列的多样性、氨基酸组成及疏水性、共有CDR3序列。体外诱导和扩增人PDC-E2_(163-176)(人PDC-E2)抗原相关T细胞和E.coli PDC-E2_(31-44/134-147/235-248)(E.coli PDC-E2)抗原相关T细胞,通过免疫组库测序技术鉴定人(和E.coli)PDC-E2抗原相关TCRβCDR3图谱,并分析其丰度变化。结果PBC患者组和健康对照组间的CD4^(+)记忆性T细胞、CD8^(+)记忆性T细胞TCRβCDR3免疫图谱多样性相似,D50指数[CD4^(+)记忆性T细胞:0.028±0.019比0.034±0.015;CD8^(+)记忆性T细胞:(1.86±2.70)×10^(-3)比(4.62±3.89)×10^(-4)]、Shannon指数(CD4^(+)记忆性T细胞:9.473±1.346比9.734±0.933;CD8^(+)记忆性T细胞:6.197±1.519比5.436±1.629)、Gini指数(CD4^(+)记忆性T细胞:0.786±0.048比0.760±0.036;CD8^(+)记忆性T细胞:0.920±0.047比0.939±0.025)等差异均无统计学意义(P均>0.05)。PBC组和健康对照组CD4^(+)记忆性T细胞和CD8^(+)记忆性T细胞间共有CDR3序列百分比差异无统计学意义[(6.47±1.43)%比(6.21±3.18)%;t=-0.21,P=0.84]。健康对照组和PBC组中序列长度为13、14、15的CDR3分子第6位和第7位氨基酸的组成频率中部分存在显著差异,疏水氨基酸组成频率近似。通过细胞培养和免疫组库测序鉴定了一系列人PDC-E2和E.coli PDC-E2抗原刺激后丰度显著上升的TCR序列。结论该研究鉴定出PBC疾病的TCR图谱特征,从TCR这个新视角阐述了E.coli在PBC疾病中的分子模拟机制。

人源M2二联体靶抗原BO-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定

目的:表达二联体BO-E2重组融合蛋白,以用于人原发性胆汁性肝硬化(PBC)的早期发现和临床诊断.方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT- PCR)方法扩增得到抗线粒体抗体二亚型(AMA-M2)的二个靶抗原侧链:二氧酸脱氢酶复合体E2(BCOADC-E2)、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2(OGDC-E2)相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28a(+)-BCOADC-E2,pET28a(+)-OGDC-E2,pET28a(+)-BO-E2,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达蛋白质.表达蛋白经SDS-PAGE、westem blot等鉴定.结果:经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了3种重组质粒.异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,获得3种融合蛋白.经免疫学鉴定,重组抗原片段具有AMA-M2的免疫原性.结论:重组表达的BO-E2融合蛋白将有利于PBC的实验室诊断.

侧链二氧酸脱氢酶复合体E2蛋白关键性氨基酸在原发性胆汁性胆管炎诊断中的意义

目的探究与自身抗体抗线粒体抗体Ⅱ型(AMA-M2)发生反应的侧链二氧酸脱氢酶复合体E2蛋白(BCOADC-E2)关键性氨基酸在原发性胆汁性胆管炎(PBC)诊断中的价值。方法克隆能够表达BCOADC-E2蛋白抗原表位同源目的基因序列BCKD, 与工程质粒pGEX-4T1进行DNA重组, 通过PCR获得15个点突变质粒, 转入原核表达菌株中进行蛋白表达与纯化;ELISA法、蛋白质印迹法鉴定其与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度并进行分析比较, 定位出对BCOADC-E2蛋白和AMA-M2特异性反应有关键影响的氨基酸, 探讨其在PBC诊断中的价值。统计学处理采用单因素方差分析、两两比较采用LSD-t检验。结果共获得14个突变型蛋白、1个野生型蛋白。突变型蛋白pGEX-BCKD-S1A和pGEX-BCKD-C3A与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度均高于野生型蛋白pGEX-BCKD与AMA-M2特异性反应程度;突变型蛋白pGEX-BCKD-S1A(1.634±0.328)和pGEX-BCKD-C3A(1.744±0.345)与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度均高于野生型蛋白pGEX-BCKD(1.000±0.000)与AMA-M2特异性反应程度;突变型蛋白pGEX-BCKD-E4A(0.157±0.067)、pGEX-BCKD-V5A(0.057±0.029)、pGEX-BCKD-Q6A(0.580±0.166)、pGEX-BCKD-S7A(0.744±0.125)、pGEX-BCKD-D8A(0.351±0.135)、pGEX-BCKD-S10A(0.496±0.158)、pGEX-BCKD-V11A(0.149±0.089)、pGEX-BCKD-T12A(0.061±0.043)、pGEX-BCKD-I13A(0.007±0.017)、pGEX-BCKD-T14A(0.198±0.101)、pGEX-BCKD-S15A(0.156±0.087)、pGEX-BCKD-R16A(0.884±0.099)与AMA-M2特异性反应程度均低于野生型蛋白pGEX-BCKD(1.000±0.000)与AMA-M2特异性反应蛋白。结论 BCOADC-E2蛋白的1号和3号位半胱氨酸是提高蛋白BCOADC-E2与PBC患者血清AMA-M2特异性反应关键性氨基酸;4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16号位氨基酸被丙氨酸代替后形成突变型蛋白会降低其与AMA-M2特异性反应程度;5号位和13号位氨基酸是影响蛋白BCOADC-E2与AMA-M2特异性反应关键性氨基酸, 对BCOADC-E2蛋白功能有着重要影响, 对BCOADC-E2关键性氨基酸进行深入研究对PBC诊治有重要意义。

抑制线粒体复合体Ⅱ诱导线粒体自噬影响细胞增殖的研究

线粒体复合体Ⅱ,也被称为琥珀酸脱氢酶,参与线粒体呼吸作用及代谢重编程的调控过程.复合体Ⅱ由4个亚基构成,其突变与肿瘤的发生密切相关.本文探讨复合体Ⅱ与线粒体自噬调控及细胞增殖之间的关系.实验采用复合体Ⅱ的特异性抑制剂TTFA或敲除复合体Ⅱ的B亚基(SDHB)使其功能缺失.结果发现,复合体Ⅱ功能的缺失显著引起线粒体形态的片段化进而发生线粒体自噬,导致线粒体蛋白水平减少,抑制ATP生成;由于线粒体功能受到抑制,细胞葡萄糖消耗及乳酸产生水平增加,并显著抑制细胞的细胞的增殖.综上所述,复合体Ⅱ功能缺失可能通过调控线粒体自噬而影响细胞增殖,从而在肿瘤发生中起重要作用.

叶绿体NAD(P)H脱氢酶(NDH)复合体的研究进展

高等植物叶绿体类囊体膜上的NAD(P)H脱氢酶(NDH)复合体是一个由多亚基组成的大复合体。它参与了围绕光系统I(PSI)的循环电子途径(CEF)和叶绿体的呼吸,为CO2同化提供额外ΔpH和ATP,并在胁迫条件下缓解基质过还原和氧化胁迫。近年来高等植物的叶绿体NDH复合体的研究有了很大进展,主要是发现了很多NDH新亚基、调控叶绿体编码的ndh基因的剪切和编辑的蛋白以及影响NDH组装和稳定的蛋白,同时,对NDH在胁迫条件下的生理功能也有了进一步的认识。本综述主要总结了NDH复合体的功能,亚基组成及调控等方面的研究进展。

亚低温对急性缺氧缺血新生鼠脑线粒体能量代谢的作用

目的 研究亚低温治疗对缺氧缺血脑损伤 (hypoxic -ischemicbraindamage ,HIBD)新生大鼠的脑线粒体琥珀酸脱氢酶 (succinatedehydrogenase ,SDH)复合酶Ⅱ的活性及ATP合成能力的影响 ,以探讨亚低温治疗的神经保护机制。方法 将HIBD模型鼠随机分为缺氧缺血 (HI)常温恢复组和亚低温干预组 ,同时设对照组。各组动物在HI后不同时间点 (0、2、6、2 4、4 8、72h)断头取脑 ,用密度离心及差速离心方法提取线粒体 ,生化法测定脑线粒体SDH和复合酶Ⅱ的活性 ,并用酶萤光法检测脑线粒体的ATP合成能力。结果 HI常温恢复组结扎侧大脑脑线粒体SDH的活性在HI后 2～ 6h先下降后再逐渐恢复 ,72h最高但仍明显低于正常 ;脑线粒体复合酶Ⅱ的活性及脑线粒体ATP合成能力在HI后 2h明显恢复 ,6h出现第 2次下降 ,72h恢复正常。亚低温干预组各时间点脑线粒体SDH活性、脑线粒体复合酶Ⅱ的活性及ATP的合成能力均显著高于同一时间点常温组 ,SDH在 72h恢复正常 ,复合酶Ⅱ在 4 8h恢复正常 ,ATP合成能力在 2 4h恢复正常。结论 亚低温可减轻HIBD鼠线粒体SDH及复合酶Ⅱ活性的下降 ,增加脑ATP的合成 ,缩短继发性能量衰竭的时间 。

Sdha基因敲低对小鼠肝细胞BNL CL.2细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响

目的探讨琥珀酸脱氢酶复合物亚单位A(SDHA)对小鼠肝细胞BNL CL.2细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法用慢病毒载体介导的sh RNA敲低BNL CL.2细胞中sdha基因的表达。流式细胞仪检测慢病毒的感染效率;实时荧光定量PCR和Western蛋白印迹法分别检测sdha m RNA和SDHA蛋白表达水平;细胞计数法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果无相关sh RNA对照组和sdha sh RNA组慢病毒的感染效率均>80%。与无相关sh RNA对照组相比,感染sdha sh RNA慢病毒载体的BNL CL.2细胞sdha m RNA水平降低20倍左右(P<0.01),蛋白表达水平降低10倍左右(P<0.01);细胞增殖速度减慢,为无相关sh RNA对照组的70%左右(P<0.05);细胞周期发生改变,G0/G1期细胞百分率是无相关sh RNA对照组的1.17倍(P<0.01),G2/M期细胞百分率为1.37倍(P<0.01),S期细胞百分率为73.8%(P<0.01);但细胞凋亡率无明显差异。结论降低SDHA表达对小鼠肝细胞BNL CL.2细胞增殖有明显的抑制作用,其抑制作用与细胞周期阻滞相关,与细胞凋亡无明显关系。

原发性胆汁性肝硬化患者血清AMA-M2及其靶抗原检测的阳性率对比

目的:针对PBC患者血清同时选用国产和进口两种试剂盒检测AMA-M2及其靶抗原:丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(PDC-E2)及抗M2-3E等免疫指标,并对其敏感性进行对比,观察两种试剂盒检测有无差异及3个指标之间的敏感性。方法:对51例PBC确诊患者的血清标本,采用上海丰翔生物公司及欧蒙公司的ELISA试剂盒对待测血清分别进行了AMA-M2、抗M2-3E、PDC-E2等指标的检测,进行阳性率的比较。结果:51例患者血清标本中,国产试剂盒检测AMA-M2、抗M2-3E、PDC-E2的阳性率分别为72.5%、90.2%、72.5%,进口试剂盒检测AMA-M2、抗M2-3E、PDC-E2的阳性率分别为78.4%、92.2%、82.4%,经统计软件处理得到的结果P>0.05,无明显的统计学差异。针对42例AMA阳性的患者进行AMA-M2、抗M2-3E、PDC-E2检测时,国产试剂盒检测的阳性率分别为85.7%、95.2%和78.6%,进口试剂盒检测的阳性率分别为95.2%、100%、95.2%,经统计软件处理后得出P>0.05,两种试剂盒检测无明显的差别。结论:使用进口和国产两种试剂盒检测AMA-M2、PDC-E2、抗M2-3E的阳性率无明显的统计学差异。AMA-M2、PDC-E2、抗M2-3E 3个指标中阳性率最高的是抗M2-3E,AMA-M2和PDC-E2差异无统计学意义。

NDUFA4L2在胶质瘤组织中的表达及意义

目的探讨乳酸脱氢酶A的α复合体4-L2(NDUFA4L2)在胶质瘤中的表达情况及临床意义。方法利用癌症基因组图谱(TCGA)、中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库分析NDUFA4L2在胶质瘤中的mRNA表达情况,分析其与患者临床病理分级和预后的关系。进一步收集不同级别的胶质瘤组织标本行免疫组化检测,验证NDUFA4L2在不同级别胶质瘤中蛋白表达的差异。收集62例胶质瘤患者的组织标本和随访资料,采用RT-PCR法检测NDUFA4L2在胶质瘤中的表达并分析其与预后的关系。结果通过分析TCGA、CGGA数据库,发现胶质瘤组织中NDUFA4L2的表达随着肿瘤分级的增高而增高(P<0.05),高表达NDUFA4L2预示着患者生存期较短。在临床标本验证中的结果与上述生物信息学分析相一致。结论NDUFA4L2在胶质瘤组织中的表达与病理分期和预后有关,可能是胶质瘤的一个潜在肿瘤标志物。

揭秘长生分子辅酶Q10

含有辅酶Q10的护肤品广告铺天盖地,已经成为化妆品界的主流。Q10广泛存在于人体细胞中,是细胞维持功能不可或缺的,但它们延缓皮肤衰老的效果却远不如宣传的那样好。

低氧预处理对氧糖剥夺人脑微血管内皮细胞线粒体呼吸功能的保护作用

目的通过观察低氧预处理对氧糖剥夺人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMVEC)低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和线粒体琥珀酸脱氢酶复合体亚基2(succinate dehydrogenase complex iron sulfur subunit B,SDHB)表达水平以及线粒体ATP合成的影响,评价低氧预处理对氧糖剥夺HBMVEC的保护作用.方法离体培养HBMVEC,采用随机数字表法将HBMVEC分为5组(每组6孔):正常对照组(A组)、氧糖剥夺组(B组)、氧糖剥夺+低氧预处理组(C组)、氧糖剥夺+低氧预处理+二甲基草酰甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)组(D组)和氧糖剥夺+低氧预处理+2-ME组(E组).给予低氧预处理及HIF-1α抑制剂和稳定剂后,对HBMVEC进行氧糖剥夺,使用Annexin V检测细胞凋亡和坏死;用ATP检测试剂盒测定细胞内ATP含量;采用Western blot法测定HIF-1α、SDHB蛋白表达.结果与A组比较,B组、C组、D组和E组HIF-1α表达水平明显升高,ATP含量明显减少,细胞凋亡率明显升高(P<0.05),B组、C组和E组SDHB表达水平明显降低(P<0.05);与B组比较,C组和D组HIF-1α和SDHB表达水平明显升高,ATP含量明显增加,细胞凋亡率明显降低(P<0.05).结论低氧预处理可通过调节HIF-1α表达改善氧糖剥夺所致的HBMVEC线粒体呼吸链复合体Ⅱ的损伤,发挥对氧糖剥夺HBMVEC模型的保护作用.

鹿骨粉对卵巢摘除大鼠心肌细胞HK-2和PDHc表达的影响

目的探讨鹿骨粉对卵巢摘除大鼠心肌组织中HK-2和PDHc表达和心肌结构的影响。方法对Wistar大鼠行双侧卵巢摘除术后,将大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、鹿骨粉不同剂量(SBP200、400及800 mg/kg)组。术后即刻给予鹿骨粉组大鼠相应剂量的鹿骨粉,每天1次,连续给药4个月后,处死各组大鼠,取出心脏,HE染色观察心肌结构,免疫组织化学染色检测HK-2和PDHc的蛋白表达情况。结果与Model组比较,SBP各组心肌组织中HK-2和PDHc蛋白表达均成增多趋势,心肌细胞核大小适中,染色较淡,细胞排列整齐,形态正常。结论鹿骨粉能够促进卵巢摘除后心肌细胞中HK-2和PDHc蛋白表达增高,维持心肌结构完整,对心脏具有保护作用。

微小RNA-938在肝细胞癌中的表达及对肝癌细胞增殖的影响

目的探讨微小RNA-938(miR-938)在肝癌组织中的表达情况及其对肝癌细胞增殖的影响和调控机制。方法收集2015年1月至2019年6月在南通大学第二附属医院就诊并手术切除的40例肝细胞癌患者肝癌组织和癌旁组织,其中男性25例,女性15例,平均年龄61.4岁。miR-938过表达组HepG2肝癌细胞转染miR-938模拟物,阴性对照组转染阴性对照序列。采用试剂盒检测细胞增殖情况,荧光定量聚合酶链反应检测miR-938及琥珀酸脱氢酶复合体亚基D(SDHD)的表达,Western印迹检测SDHD蛋白表达。双荧光素酶报告实验验证miR-938的靶基因。结果肝癌组织中miR-938相对表达量为(0.060±0.002),高于癌旁组织(0.030±0.002),差异有统计学意义(P<0.05)。肝癌组织中SDHD mRNA相对表达量为(0.028±0.002),低于癌旁组织(0.062±0.002),SDHD蛋白相对表达为(0.963±0.008),低于癌旁组织(1.083±0.037),差异均有统计学意义(均P<0.05)。miR-938过表达组细胞增殖活力明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告结果显示只有miR-938模拟物和pGL3-SDHD野生型质粒组荧光素酶活性下降。阴性对照组SDHD mRNA和蛋白相对表达量均高于过表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-938在肝细胞癌患者肝癌组织中高表达,miR-938可能通过抑制SDHD的表达,促进肝癌细胞增殖。