细胞培养用琼脂微球的制备与初步应用

用4%的琼脂溶液作为水相,环己烷为油相,司盘-80为乳化剂,采用乳化分散法制备了琼脂微球,再通过化学交联法固化.用DEAE-HCl修饰了微球表面的电荷密度,并通过正交试验优化了改性工艺,最终制得细胞培养用琼脂微球.通过对比研究了Cytodex1微载体与琼脂微球的表征及细胞培养效果.结果显示,最优改性工艺为:加入微球2倍体积4.5 mol/L的Na OH溶液,再加入微球2倍体积2.5 mol/L的DEAE-HCl溶液,在搅拌状态下加热至60℃,密闭反应4 h.最终制得琼脂微球表面电荷密度为4.00 mmol/100 g,与Cytodex1微载体的4.05 mmol/100g几乎相当.静置培养时,四种细胞在两种微球上的贴壁率和伸展性各有优劣.悬浮培养BHK-21细胞时,Cytodex1微载体表面出现一定程度的"空球"现象,而琼脂微球表面细胞较均匀地伸展.培养至120 h时,两种微球表面的细胞均达到4.5×107cells.继续培养,Cytodex1表面的细胞数开始下降,而琼脂微球表面仍增殖至168 h时才开始下降.综上所述,自制琼脂微球具备作为细胞培养用材料的条件.

琼脂微球偶联氨基化合物及其效果分析

琼脂微球表面偶联了氨基这一易被氧化的亲和性基团,制备了对口蹄疫病毒抗原的亲和作用.以琼脂微球为基质,通过正交试验筛选、凯氏定氮法测定,选取最优偶联条件下的琼脂微球介质,用其亲和吸附口蹄疫病毒灭活抗原,检测其亲和吸附效果.结果显示:琼脂微球15 g,环氧氯丙烷15 mL,3 M NaOH 30 mL,40℃活化反应3.5 h;6 mL苯乙胺,2 M NaOH 20 mL,50℃偶联反应2.5 h.该条件偶联后的含氮量是0.4486%,得到的该介质对口蹄疫灭活病毒抗原的层析效果和某生产疫苗的药厂的分离纯化效果相似,表明该自制介质对分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原具有一定的应用潜力.

基于琼脂糖微球金属螯合层析介质的制备及性能评价

以琼脂糖凝胶微球为研究对象,通过对微球进行化学交联与配体连接,制备系列金属螯合亲和层析介质,并测试其在模型蛋白中的吸附性能。首先,探究不同工艺条件对微球尺寸的影响。结果表明,在最优条件下,琼脂糖微球粒径集中在45~160µm之间,收率为95%,平均粒径为91.2µm。随后,以琼脂糖微球4B和6B为原料制备交联琼脂糖微球4FF(4FastFlow)和6FF(6FastFlow),调控交联剂滴加方式,探究不同因素对4FF微球机械强度的影响,所得4FF和6FF的最大流速分别达1190cm/h和2228cm/h。此外,本工作对制备的4FF微球进行复原性能测试及形貌表征,借助凝胶色谱法测定不同标准蛋白的保留体积,并计算有效分配系数。最后,以交联琼脂糖微球6FF为基质,制备葡聚糖接枝型金属螯合亲和层析介质,以单克隆抗体IgG为模型蛋白,探究不同条件对介质动态蛋白载量的影响。结果表明,介质的最高动态蛋白载量可达44.8mg/mL gel。本工作为琼脂糖微球的可控制备、改性,以及在生物蛋白分离纯化中的应用提供了新思路,也为后续扩大化生产奠定了基础。

磁性琼脂糖微球固定化血管紧张素转化酶的制备及性质

采用反相悬浮包埋法制备磁性琼脂糖微球,然后以环氧氯丙烷为活化剂固定血管紧张素转化酶(ACE)。探讨了ACE固定化的影响因素,确定了固定化最适条件:酶溶液蛋白质量浓度为8 g/L,p H=7.8,温度为50℃,固定化时间为2 h,所得的固定化酶的活力达到0.128 U/g;对磁性固定化ACE的性质进行了研究,固定化ACE最适温度为42℃,最适p H=8.3。同时,比较了磁性固定化与游离ACE对p H的耐受力和热稳定性,在p H=5的缓冲液中放置1 h后,固定化ACE和游离ACE酶活力保留率分别为62.1%和40.7%,当p H=9,两者酶活力保留率分别为95.7%和89.2%;60℃时,两者酶活力保留率分别为50.2%和20.7%;-20℃储存30 d后,两者酶活力保留率分别为90.3%和43.0%;连续操作10次后,固定化ACE活力仍保持53.0%。研究表明,磁性固定化ACE在外加磁场的作用下可快速重复回收利用,具有良好的应用前景。

铁琼脂糖磁性微球的制备和表征

采用反相悬浮包埋法制备了以纳米铁粉为磁核、琼脂糖为壳层的铁琼脂糖磁性微球,其磁响应性比以四氧化三铁为磁核的琼脂糖磁性微球好得多;并对不同粒径的琼脂糖磁性微球表面的活性基团进行了测定,粒径为8.3μm的铁琼脂糖磁性微球的表面活性羟基数目是4.02×1015个.mg-1。

微孔膜乳化法制备大粒径琼脂糖微球

以6%的琼脂糖溶液为水相,不同体积配比的液体石蜡(LP)和石油醚(PE)的混合溶液为油相,PO-5S为乳化剂,采用微孔膜乳化法制备了平均粒径为90μm的琼脂糖微球.考察了SPG膜孔大小、油相组成、反应温度、压力等因素对成球粒径及其分布的影响.结果表明,在使用膜孔为25.9μm的微孔膜、LP/PE体积比为11:1及65℃的条件下可制得均一的大粒径琼脂糖微球,微球平均粒径为93.3μm,粒度分布系数为1.25,且各批产品的相对标准偏差仅为1.34%,产品重复性良好.

基于点击化学的琼脂糖微球上溶菌酶定点偶联方法研究

以溶菌酶为模型,研究了一种基于点击化学的琼脂糖微球上蛋白质定点偶联方法。首先将琼脂糖微球使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚活化后与对氨基苯乙炔反应,将炔基引入琼脂糖微球。其次合成了叠氮基癸酸,通过EDC/NHS法将叠氮基癸酸偶联到溶菌酶表面,将不同修饰位点的溶菌酶进行色谱分离后,通过点击化学使溶菌酶分子上叠氮基与琼脂糖微球表面上的炔基进行反应。XPS分析结果表明偶联对氨基苯乙炔后的琼脂糖微球表面出现N元素,证明炔基成功偶联在微球表面。采用合成的叠氮基癸酸对溶菌酶进行修饰,质谱分析结果表明叠氮基主要出现3个位点,Lys^1、Lys^(33)和Lys^(96)。将偶联位点为Lys^(96)的溶菌酶进行了分离,通过点击化学反应将溶菌酶偶联在琼脂糖微球表面,质谱分析结果表明偶联的溶菌酶其酶解产物中未检测出多肽Gln^(74)-Lys^(96),证明溶菌酶通过Lys^(96)偶联在琼脂糖微球表面。该研究为偶联位点均一、可控的蛋白质偶联方法提供了参考。

羧甲基琼脂糖微球的制备及其在国产碱性蛋白酶纯化中的应用

以琼脂糖粉末为原料,利用反相悬浮原理制备琼脂糖凝胶微球。所得琼脂糖微球的粒径分布在45～165μm范围内,并对其进行了交联。以自制交联琼脂糖微球为基质,对其进行了羧甲基化反应。依据离子交换容量进行键合量的表征,综合考察了各种反应试剂的用量、反应温度、反应时间等条件对键合量的影响。将所得的羧甲基键合微球用于碱性蛋白酶粗品的分离纯化,结果表明,自制羧甲基弱阳离子交换填料对国产碱性蛋白酶具有较好的分离纯化、除色以及除味等作用,可以达到国外同类产品的效果。

DEAE-琼脂凝胶微球的制备及在R-PE和C-PC提取分离中的应用

为了降低天然大分子功能蛋白的分离纯化成本,以琼脂为原料自制弱阴离子交换层析介质DEAE-琼脂凝胶微球。将DEAE-琼脂凝胶微球应用于坛紫菜R-藻红蛋白（R-PE）和螺旋藻C-藻蓝蛋白（C-PC）的提取分离,最佳洗脱条件为：层析柱规格h=35.0 cm,φ=1.0 cm,V=27.5 m L;流速v=0.33 m L/min;洗脱缓冲液为0.01 mol/L磷酸盐溶液（含有0.05~0.5 mol/L Na Cl溶液）;0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（含0.1 mol/L Na Cl）洗脱出纯度为5.0的坛紫菜R-PE;0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（含0.2 mol/L Na Cl）洗脱出纯度为4.4的螺旋藻C-PC。自制层析介质成本低廉、耗能少、可大量制备、分离效果好,可用于坛紫菜R-PE、螺旋藻C-PC的产业化制备。

磁性琼脂糖微球的制备及其蛋白吸附性能研究

以琼脂糖、纳米Fe_3O_4等为原料,采用反相悬浮再生法制得磁性琼脂糖微球,并偶联苄胺功能配基.采用X射线衍射、红外光谱、扫描电子显微镜等方法对微球进行表征.结果表明,微球球形度好,尺寸大小均一,平均粒径为60μm.包裹的Fe_3O_4含量约为10%,呈反式尖晶石结构.将微球用于分离牛血清蛋白(BSA),pH 5.0下对BSA的最大吸附容量为79mg/g,反复使用5次吸附容量降至原来的76%,表明微球吸附性能良好.

免疫磁性微球的制备及对IgG的分离

采用反相悬浮包埋法制备SPA-Sepharose免疫磁性微球,并对产物的结构、粒径、磁性能进行了表征,所得产物粒径大约为5μm,表面包裹葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal Protein A,简称SPA),分散性较好,具有超顺磁性。利用SPA对免疫球蛋白G(IgG)的特异性吸附反应及磁性微球的超顺磁性,从猪血清中分离IgG,试验结果表明:SPA免疫磁性微球对猪血清的最大吸附效率是70.12%,可反复使用29次。

复乳法制备大孔琼脂糖分离介质与疫苗结合性能研究

大孔分离介质在分离纯化特别是超大生物分子分离纯化领域具有十分重要的应用意义。受材料性质和制备技术所限制,大孔分离介质以聚合物材料最为常见,针对琼脂糖的大孔分离介质较为少见。通过复乳法制备大孔琼脂糖微球,研究制备条件对微球形貌与成孔情况以及粒径与分布等的影响,发现该微球具备微米级超大孔结构,且制备条件对孔道结构的影响呈现一定规律,琼脂糖溶液浓度、内/外油相与水相比例、初乳转速和成球转速等都对成孔性至关重要。激光共聚焦显微镜实验结果表明,衍生后的大孔琼脂糖分离介质对乙肝表面抗原具有良好的结合能力,使其能够完全进入微球内部。与传统琼脂糖介质相比,大孔琼脂糖介质能够更快速、充分结合大分子疫苗,在超大分子分离纯化领域应用前景广阔。

键合β-环糊精琼脂凝胶微球分离纯化大豆苷元及其色谱机制研究

目的 通过制备键合β-环糊精琼脂凝胶微球（AG-β-CD）作为分离介质,对大豆异黄酮粗品中大豆苷元进行高效分离纯化。方法 利用琼脂为原料,通过乳化、交联并键合功能基团β-环糊精（β-CD）制备AG-β-CD;将其作为一种分离介质,通过考察流动相、洗脱体积流量和微球负载量3个方面,确定AG-β-CD分离纯化大豆苷元的工艺并进行验证,质谱和核磁共振鉴定其结构;通过与其他2种黄酮类物质表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和葛根素在C18反相柱色谱保留行为比较,结合auto DOCK4.0进行分子模拟,以及流动相乙腈体积分数变化对3种黄酮类物质在AG-β-CD固定相上的保留时间的变化曲线证明其色谱机制。结果 大豆异黄酮粗品中主要成分为大豆苷元（57.14%）,AG-β-CD的负载量为1.33 mg/m L（大豆异黄酮粗品总量/柱体积）,体积流量为2 BV/h时,通过20%乙醇洗脱2 BV、40%乙醇洗脱1.33 BV、70%乙醇洗脱6~7 BV,得到质量分数≥95%（平均质量分数96.98%）的大豆苷元,收率为97.86%。色谱机制实验表明AG-β-CD具有亲水和反相双重保留与分离作用。结论 AG-β-CD能够高效地分离纯化大豆苷元。

改性琼脂糖微球固定化甘油脱氢酶的研究

通过膜乳化法制备琼脂糖微球,利用环氧氯丙烷活化琼脂糖微球,并与聚乙烯亚胺(PEI)反应引入氨基,得到胺化琼脂糖微球。利用扫描电子显微镜(SEM)、X射线能谱(EDS)、X射线光电子能谱(XPS)、傅立叶变换红外光谱(FTIR)等手段对微球的形貌和结构进行表征。通过戊二醛(GA)共价固定甘油脱氢酶(GlyDH),并催化甘油生成1,3-二羟基丙酮(DHA)。结果表明,膜乳化过程可改善载体的球形度,PEI分子量对接枝微球的N元素含量有显著影响。固定化酶的储存稳定性和循环使用性均高于游离酶。

琼脂凝胶微球纯化葛根素的工艺研究

葛根素是葛根中黄酮类物质主要活性成分,该研究以葛根素粗品为原料,利用廉价易得的琼脂制备琼脂凝胶微球键合β-环糊精分离介质(AG-β-CD),结合AB-8大孔树脂进行前处理,以高回收率分离纯化得到高纯度的葛根素。以葛根素纯度和回收率以及相关杂质的色谱纯度为考察指标,对4种不同性质的大孔树脂ADS-7(强极性)、ADS-17(中极性)、ADS-21(极性)和AB-8(弱极性)进行分离效果筛选以及工艺优化,并对AG-β-CD纯化工艺优化和验证。结果表明,优选弱极性树脂AB-8作为葛根素粗品的前处理树脂效果最佳,通过8%乙醇洗脱15 BV后,葛根素纯度为87.68%的回收率达到89.66%;通过琼脂凝胶微球键合β-环糊精分离介质进行纯化,流动相15%乙醇,承载量(上样量与柱体积之比)1.33 g·L^(-1),上样浓度8 g·L^(-1),流速1 m L·min^(-1)时,葛根素纯度高于95%的回收率达到97%以上。

镍离子亲和层析介质的制备及其用于组氨酸标记蛋白质的纯化

以交联琼脂糖微球为基质,通过环氧氯丙烷活化,偶联亚胺二乙酸并螯合N i2+,制备得到一种镍离子亲和层析介质。结果发现,在强碱条件下环氧活化率达到了38.0μmol/mL,最终N i2+配基密度达到了30.9μmol/mL,偶联效率为81.3%。利用得到的镍离子亲和介质对基因工程大肠杆菌表达的组氨酸标记3-羟基丁酮还原酶进行了一步层析纯化,酶活回收率达到了58.8%,纯化倍数为2.1,蛋白纯度在85%左右,纯化效果与常用商品介质基本相当。

汽巴蓝F3GA染料亲和色谱介质的制备及其对黑芸豆凝集素的特异性吸附

采用反相悬浮再生法制备6 g/100 mL的琼脂糖微球,采用环氧氯丙烷对琼脂糖微球进行二次交联,并进行染料配体汽巴蓝F3GA的偶联,得到一种新型活性Blue Beads 6FF微球。通过傅里叶变换红外光谱、扫描电子显微镜、压力流速曲线、溶胀率、泄漏率和孔隙率等对微球物理性能进行表征。结果发现,微球球形度较好,粒径大小均一,平均粒径为56.37μm左右,具有较高的孔隙率、溶胀率及广范围的pH值稳定性,且耐压能力强。以黑芸豆凝集素为目标蛋白,通过Langmuir吸附等温式拟合,结果表明该填料对黑芸豆蛋白有较高的吸附量(19.7 mg/mL),微球吸附性能良好,可实现对凝集素蛋白的快速分离和纯化。