微量琼脂糖弥散法抗菌试验的建立及应用

作者建立了两种微量而敏感的抗菌试验，可用于鉴定存在于细胞及组织中的抗菌蛋白或多肽。①琼脂糖弥散法，用其检测抗菌蛋白的抗菌活性，具有操作简便、灵敏度高、样品用量少（ｎｇ水平）、可同时检测多个样品及定量检测等优点；②电泳凝胶琼脂糖弥散法，该法在微量样品来经纯化的情况下，可直接确定存在于ＰＡＧＥ凝胶中抗菌蛋白条带。应用这两种方法作者首次鉴定出大鼠膀胱粘膜、人膀胱粘膜以及大鼠子宫内膜存在抗菌蛋白。

HMGN2的重组表达质粒的构建及其抗菌功能研究

目的:构建HMGN2重组表达载体,探讨HMGN2分子抗菌作用。方法:用基因克隆的方法构建pET-32 a-c(+)-HMGN2重组表达质粒,经IPTG诱导表达后,用亲和层析的方法纯化H is-HMGN2融合蛋白,Tric ine-SDS-PAGE电泳鉴定其分子量,行琼脂糖弥散法检测其抗菌功能。结果:成功构建了pET-32 a-c(+)-HMG17重组表达质粒,其表达的融合蛋白对致病性大肠杆菌54080,54299以及金黄色葡萄球菌ATCC25923均有抗菌活性。结论:HMGN2是一种抗菌分子,可能参与了体内的天然免疫防御作用。

人子宫内膜粘液抗菌多肽的分离纯化

目的 :分离纯化人子宫内膜粘液抗菌多肽。方法 :采用酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖弥散法检测子宫内膜粘液酸溶性提取物抗菌活性 ;琼脂糖电泳洗脱相应抗菌条带 ,HPLC进一步分离纯化 ,琼脂糖弥散法检测纯化分子抗菌活性 ,Tricine SDS PAGE电泳检测其分子量。结果 :从人子宫内膜酸溶性提取物中纯化出一分子量约为 6KD左右的抗菌多肽 ,对大肠杆菌氨苄青霉素耐药株 (E .coli.ML 3 5P)有抗菌活性。结论 :HUP可能是一种新的子宫内膜分泌的抗菌多肽 ,参与了子宫的天然防御机制。

重组人β-防御素3对铜绿假单胞菌生物膜结构影响的初步研究

目的研究重组人β-防御素3(rhBD-3)对铜绿假单胞菌(PA)形成生物膜的体外抑制作用。方法平板培养法培养PA,得到早期和成熟期生物膜;琼脂糖弥散抗菌法测定最低抑菌浓度(M IC);扫描电镜(SEM)观察载体表面BF形态;连续稀释法行活菌计数。结果 rhBD-3对PA的M IC值是64μg/m l。rhBD-3作用后8、16、24 h,膜片载体表面PA活菌黏附量减少,且随着rhBD-3浓度的增高,活菌群数量进行性减少;SEM观察见rhBD-3组少量散在的游离细菌,有少量小斑片状多糖复合物,而空白对照组可见大量分布均匀的微菌落和游离细菌及多糖复合物交联。结论 rhBD-3可以抑制PA的BF形成,并对早期和成熟期BF具有破坏作用。

人子宫颈黏液抗菌多肽的分离和鉴定

目的 从人的子宫颈黏液分离和鉴定新抗菌多肽,探讨子宫颈黏液抗菌机制。方法 用5%乙酸提取人子宫颈黏液可溶物,应用电泳凝胶抗菌蛋白分析法分析其抗菌蛋白,制备酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳及反相高效液相色谱分离纯化抗菌多肽。凝胶琼脂糖弥散法抗菌检测抗菌活性。纯化的抗菌多肽进行氮端氨基酸序列测定,根据其序列设计简并引物,利用简并聚合酶链反应(PCR)技术扩增其全长cDNA。通过BLAST硷基比对程序分析比较与已知蛋白的同源性。进一步应用常规基因重组技术构建其原核表达质和制备重组多肽。采用最小抑菌浓度和最小杀菌浓度检测重组多肽的抗菌效能。结果 从子宫颈黏液中分离纯化到一个具抗菌活性的多肽,通过蛋白测序、简并PCR及BLAST等方法鉴定该蛋白为HMGN2高游动性蛋白。制备获得重组HMGN2多肽,重组HMGN2抗大肠杆菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度分别为10 .42μg/ml±3. 13μg/ml和27. 78μg/ml±8 .33μg/ml,与人中性粒细胞防御素相当;最小杀菌浓度分别为20 .83μg/ml±6 .25μg/ml和55 .56μg/ml±16 .67μg/ml。结论 除已知的抗菌肽外,HMGN2亦可能是宫颈黏液含有的抗感染效应分子之一。