纤维蛋白平板法测定纳豆激酶方法的改进

对利用琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活力的方法进行了改进,对测定纳豆激酶活力的标准曲线的规律进行了研究。研究发现,当尿激酶活力在200U/mL～10000U/mL时,尿激酶活力的常用对数lgU与对应的溶圈面积S呈线性相关,其表达式的斜率与孵育时间、孵育温度和平板厚度有关。通过试验确定了测定纳豆激酶活力的最佳孵育时间为15h,此时的酶活测定标准曲线为:lgU=0.0052S+b,b值的确定方法为:将2种标准尿激酶液的酶活力和对应的溶圈面积分别带入标准曲线lgU=0.0052S+b中,分别求出其对应的修正系数b1、b2,以b=b1+2b2为标准曲线lgU=0.0052S+b的修正系数,利用此法计算酶活力的相对误差为0.22%。

ATP和钾离子对肌动蛋白与前纤维蛋白结合的影响及其在植物肌动蛋白纯化中的应用

根据ATP和钾离子影响肌动蛋白聚合及肌动蛋白与前纤维蛋白结合的实验结果 ,通过对以往报道的利用多聚脯氨酸_琼脂糖亲和柱层析法纯化植物肌动蛋白过程中ATP及钾离子浓度的改变 ,不需加外源前纤维蛋白 ,可得到较大量高纯度具活性的花粉肌动蛋白。SDS凝胶电泳、免疫印迹、电镜负染及紫外检测表明 ,所得肌动蛋白在纯度、聚合特性等方面均与原方法所得结果相同。肌动蛋白产率为原方法的 73.5 % ,而整个肌动蛋白提纯过程所需时间缩短了 1/3,节省了纯化重组前纤维蛋白所需的费用 ,消除了外源前纤维蛋白的使用对一些实验室的限制 ,而且同时得到了大量纯化的花粉前纤维蛋白。

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在转基因烟草中的表达

实验室构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t-PA)植物表达载体并转化入根瘤农杆菌GV3101。该农杆菌以叶盘法转化烟草,建立表达t-PA的转基因烟草体系。通过对转化植株进行Southern blotting,RT-PCR,Western blotting和纤维蛋白琼脂糖平板(fibrin-agarose plate assay,FAPA)法检测,结果显示,在转基因烟草中成功地表达出有活性的人t-PA。

不同纳豆产品纳豆激酶纤溶活性的比较

本研究对不同品牌纳豆产品的纳豆激酶的纤溶活性进行了比较,并检测了纳豆激酶的pH稳定性和热稳定性.在实验室条件下,通过盐析法浸提、硫酸铵分级沉淀,从纳豆中提取纳豆激酶,通过建立琼脂糖—纤维蛋白板对样品进行点样试验,测其纤溶活性并比较.结果表明,美屋大粒纳豆和美屋黑粒纳豆的纳豆激酶纤溶活性较高;纳豆激酶的纤溶活性最适pH为8,当pH<5时,纳豆激酶失去活性;纳豆激酶在40℃以下时活性稳定,超过70℃,酶活力显著下降.

纳豆激酶活性测定方法的比较

纳豆激酶是由纳豆芽孢杆菌经发酵产生的一种丝氨酸蛋白酶,可用于溶栓药物的开发。本文比较了两种测定纳豆激酶活性方法:琼脂糖——纤维蛋白平板法和枯草杆菌蛋白酶活力测定方法,为快速、准确地标示纳豆激酶的效价提供技术支撑。

发酵纳豆中加入中药后对纳豆激酶活力的影响

目的:通过对纳豆发酵中加入中药苦参、板蓝根、漏芦、红花后纳豆激酶活力的改变进行研究,从而筛选出能够提高纳豆激酶活力的中药,同时也将中药之药性融入其中,以便更好地提高纳豆之医疗、保健功能。方法:本实验采用纤维蛋白-琼脂糖平板法测定发酵后产物中纳豆激酶的活力大小。结果:苦参、板蓝根可提高纳豆激酶活性,漏芦可降低纳豆激酶活性,红花可抑制枯草芽孢杆菌的生长使之没有活性。结论:发酵纳豆中加入中药后对纳豆激酶的活力有不同程度的影响。

重组纳豆激酶工程酵母菌发酵研究

利用在纤维蛋白平板法基础上进行改造的纤维蛋白原—琼脂糖平板法,筛选具有纳豆激酶活性的基因工程酵母菌。并用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶纤溶活性。通过甲醇诱导从近100个菌落中筛选出5株纳豆激酶活性较高的重组纳豆激酶工程菌。同时确定了重组纳豆激酶酵母菌的最佳甲醇诱导浓度2%,产酶高峰时间为96h。

蚓激酶中激酶活性蛋白质组成分析及效价测定

将来自不同生产企业的蚓激酶样品采用胰蛋白酶酶解,采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)技术对蚓激酶的蛋白质及多肽进行来源检定,采用PLGS 3.0软件及蛋白质谱库分析处理数据,鉴定了5家企业的蚓激酶样品中激酶样活性蛋白组分,结果均鉴定出8~9种与纤溶活性相关的蛋白,其中各有4~5种属于激酶蛋白组分。以尿激酶为对照,使用琼脂糖-纤维蛋白平板法对蚓激酶中的激酶活性进行确证,并初步建立了蚓激酶中激酶活性效价的测定方法。结果每1 000 IU蚓激酶相当于尿激酶1.509 1~2.819 1 IU。本试验通过UPLC-Q-TOF-MS技术分析,鉴定了蚓激酶中的具有激酶活性的蛋白成分,并对其激酶活性进行了初步定量。

基于酶活性的丹参茎叶活血活性谱-效模型

目的:以12批丹参茎叶为研究对象,为究其HPLC指纹图谱中色谱峰和活血活性的相关性,建立其基于酶活性的活血活性谱-效模型并进行验证。方法:采用高效液相色谱法和纤维蛋白原平板法,测定6批丹参茎叶的指纹图谱和体外活血活性值,用对照品对指纹图谱特征峰进行指认,并对指纹图谱特征峰成分与其活血活性进行相关分析;运用SPSS软件,采用主成分分析-相关性分析-多重线性回归的分析方法建立其谱-效模型,采用6批丹参茎叶对该模型进行验证。结果:丹参茎叶指纹图谱中得到7个特征峰,由Kendalls tau-b相关性分析可证明丹参茎叶活血活性与7个色谱峰峰面积有相关性,陡坡图分析得该模型的最优主成分数为5,经指认分别为原儿茶醛,咖啡酸,共有峰5(未指认),迷迭香酸和丹酚酸B。其中原儿茶醛、共有峰5和丹酚酸B对活血作用显正相关,咖啡酸(CA)和迷迭香酸(PCA)对活血作用显负相关,预测值和实测值的平均相对误差较小。结论:该实验建立的基于酶活性的活血活性谱-效模型可较好地预测丹参茎叶的活血活性。

纳豆激酶活性测定的方法与酶活性单位

纳豆激酶(Nattokinase,NK)是一种具有溶栓功能的丝氨酸蛋白酶,与临床溶栓药物相比,具有价格低、效率高、可口服、无毒副作用等优点,是一种理想的预防和治疗血栓疾病的天然活性物质。基于纳豆激酶的天然生物酶学性质,目前市场产品的酶活性检测方法与活力单位的使用存在不同。NK的活性测定方法大致可分为两类:一是通过生物学方法,利用NK溶解纤维蛋白的特性测定其纤溶活性,如琼脂糖-纤维蛋白平板法、血清板法、纤维蛋白块溶解时间法(CLT)、酶联反应吸附法等。二是以NK的水解活性为基础来测定其活性,比如甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯(TAME)法、酪蛋白水解法、四肽底物法等^([1])。NK的活性表示单位有“U”、“IU”和“FU”一、NK活性测定方法(一)生物学方法1、琼脂糖-纤维蛋白平板法琼脂糖-纤维蛋白平板法的原理是用琼脂糖作为固体支持,以凝血酶和纤维蛋白原作用后制成人工血栓平板,取NK样品点于平板上,37℃恒温孵育18h,用溶解圈垂直直径的乘积(mm2)来表示纤溶活力。

纳豆激酶活性的检测及纳豆粉筛选

对纳豆激酶活性的检测方法进行了总结,结合生产及操作人员的实际情况总结出适合企业操作及评估的检测方法,并利用该方法对6种纳豆粉原料进行筛选,选择溶栓功能稳定、纳豆粉溶解性良好并经过脱臭处理的原料用于产品的生产。

量反应平行线法在溶栓胶囊蚓激酶效价测定方法学研究中的应用

目的：建立蚓激酶的效价测定方法,并引入生物检定统计法控制实验误差。方法：用标准曲线法和生物检定的量反应平行线法统计计算效价,从方法耐用性、专属性、线性范围、供试品处理方法、精密度、重复性、溶液稳定性、回收率、统计计算方法等方面对溶栓胶囊中蚓激酶效价测定的琼脂糖纤维蛋白平板法进行了方法学研究。结果：不同琼脂糖、不同纤维蛋白原对本法测定影响较小,阴性对照无干扰;本法线性范围为12.5~400 U,精密度RSD 3.2%,重复性RSD 8.3%,回收率97.0%,RSD 16.6%;供试品溶液在4℃下72 h内稳定;用本法可以将测定误差由60%~70%降低到2%左右。结论：琼脂糖纤维蛋白平板法可以快速、简便、准确地测定蚓激酶的活性,用生物检定的量反应平行线法可以控制测定的误差。

Modeling of the fibrin agarose plate assay and its application for thrombolytic analysis

The fibrin agarose plate assay is widely used in the detection of thrombolysis efficacy. However, a rigorous mathematical model for analyzing data or comparing activities of different thrombolytics has been absent. This study investigated the relationship between thrombolysis radius, R, and diffusion time, t, of molecular medicines in an agarose hydrogel system by deriving a model based on Fick's law and experimental verification by the fibrin agarose plate assay method. The theoretical results showed that a plot of log(R) versus log(t) has a linear curve with the slope of 1/2 and this was verified by experimental results using urokinase as a modeling agent. Moreover, it was found that R÷t is constant for a specific thrombolytic and can be used as a parameter for evaluating activities of different thrombolytics. The theoretical model has potential for improving the understanding of mecha-nisms involved in molecular medicine diffusion and offers benefits for thrombolytic therapy.