重组肠激酶酶切Trx-rPA融合蛋白的研究

重组肠激酶(rEK)酶切重组硫氧还蛋白瑞特普酶融合蛋白(Trx-rPA),环境pH较高,rEK的酶切活性也较强,但融合蛋白裂解后产生的瑞特普酶(rPA)易转化成降解rPA。Lys对rEK酶切Trx-rPA的活性及对rPA向降解rPA的转化均无抑制作用。氨基己酸对rEK酶切活性的抑制作用与Arg相似,但对rPA有较好的保护作用。

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的复性纯化

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及组织纤溶酶原激活剂(t-PA)等。本研究利用大肠杆菌高密度发酵表达ETI,产物以包涵体形式存在,经体外以脉冲稀释的方式复性并纯化后,每升发酵液可得ETI1000mg以上,纯度大于95%,比活为1.55IU/mg。ETI制成的ETI-Sepharose亲和胶,每ml可吸附重组瑞特普酶融合蛋白(Trx-rPA)2mg,可应用于制备t-PA及其衍生物如r-PA等药用蛋白。

大肠杆菌表达Trx-rPA融合蛋白的复性纯化

大肠杆菌高密度发酵以包涵体形式表达融合蛋白Trx-rPA,表达量22%。包涵体蛋白洗涤后经金属螯合层析纯化,纯度达80%以上。经胱氨酸衍生,以脉冲加样形式复性,复性率可高达30%。经ETI-Sepharose纯化,复性的融合蛋白生物活性可达3.5×105IU/mgPr.。融合蛋白可被rEK酶切释放rPA,酶切效率达85%以上。酶切液经IDA-Sepharose和SP-Sepharose层析纯化,rPA纯度达98%以上,生物活性50万IU/mgPr.。1L发酵液经分离、复性及纯化后,可得高纯度rPA300mg以上。