耐高温瓜枝孢非亲和菌株筛选及其诱导黄瓜抗黑星病的研究

高温处理瓜枝孢菌(Cladosporium cucumernium)分生孢子获得了耐热、低致病力的非亲和菌株,试验证明菌株的非亲和性长期保持稳定。耐高温瓜枝孢非亲和菌株可显著激发黄瓜(Cucumis sativus L.)对黑星病的抗性,其诱导抗病的能力稳定遗传,但诱导抗病性表达有一迟滞期。诱导接种浓度越高,诱导抗病效果越显著,挑战接种浓度高,诱导的抗病效果差。

瓜枝孢弱毒菌株基因组分析

经高温筛选到具有弱致病性的瓜枝孢菌株2R、3R。经稳定遗传特性试验表明,菌株2R经15代繁殖后弱致病性仍然得到稳定遗传。采用RAPD和AFLP技术在全基因组水平分析了高温诱导产生的瓜枝孢弱毒菌株的变化。结果表明AFLP技术可以有效地揭示弱毒菌株的DNA的变异,瓜枝孢经50℃高温处理后基因组发生了显著的变化。AFLP图谱分为三种:一种是弱毒菌株和野生型菌株的扩增谱带基本相同;另一种是弱毒菌株产生的谱带一部分与野生型菌株相同,同时出现新的扩增片段;第三种情况是弱毒菌株有新的DNA片段产生,但是与野生型菌株相同的大部分主带消失。256个AFLP引物组合在扩增2R/2Q和3R/3Q时(瓜枝孢弱毒菌株2R和3R,野生型菌株2Q和3Q),分别在2910和2216个位点上有DNA片段产生,2R与2Q以及3R与3Q的遗传相似性分别为24.81%和43.68%。

瓜枝孢弱毒菌株诱导黄瓜抗病相关基因表达的cDNA-AFLP分析

利用cDNA-AFLP技术,分析瓜枝孢弱毒菌株诱导黄瓜苗后72h内抗病相关基因的差异表达。结果显示,诱导的基因表达差异始于接种后3h,接种后6h差异表达片段总数达到高峰。8个取样时间点的诱导性差异表达片段数大于抑制性表达片段数。仅在接种后第12h呈现相反趋势。通过回收、克隆、测序和同源性比对,获得的5个片段分别与拟南芥中病原菌诱导的水杨酸糖基转移酶、梨磷脂酶C编码的基因等具有较高的同源性,初步推断瓜枝孢弱毒菌株诱导黄瓜抗病可能是通过依赖于水杨酸介导的信号传导途径诱导黄瓜的系统抗病性(system acquired resistance,SAR),作为胁迫抗性信号传递中的关键酶——磷脂酶C可能参与了上述过程。经Northern杂交结果证实,克隆分离的DNA差异片段是瓜枝孢弱毒菌株诱导表达的特异片段。