细胞凋亡清除障碍及瓣状内切核酸酶1基因变异在狼疮性肾炎发病机制中的作用

目的:探讨细胞凋亡清除障碍及瓣状内切核酸酶1(Fen1)基因变异在狼疮性肾炎(LN)发病机制中的作用。方法:首先收集30例LN患者肾穿刺组织,用TUNEL法检测细胞凋亡,探讨LN病理分型、系统性红斑狼疮(SLE)活动度评分2000(SLEDAI2000)与肾脏组织细胞凋亡指数(AI)的关系;其次,收集50例LN患者,25例健康者,20例胃癌患者的外周血标本,采用全血基因组DNA柱式试剂盒提取DNA,筑巢PCR扩增Fen1基因61563142～61563342目的片段,扩增后对目的基因进行测序,并将测序结果与基因数据库中人Fen1基因进行比较,计算突变位点频率,比较LN患者、胃癌患者、健康者Fen1基因突变情况。结果:(1)所有患者肾组织凋亡检测均为阳性,凋亡细胞在肾小球及肾小管均呈散在分布,SLEDAI与其AI呈正相关(r=0.39,P<0.05)。根据ISN/RPS2003制定的病理分型标准,30例LN患者中,病理类型以Ⅳ型最多(40.00%),其次为Ⅱ型(26.67%),Ⅲ型16.67%,Ⅴ型13.33%,Ⅵ型3.33%,无Ⅰ型病变患者。(2)三组Fen1基因61563142～61563342目的片段未发现有统计学意义的碱基变异。结论:LN患者存在细胞凋亡清除障碍,凋亡细胞的数量越多,SLE病情越活跃;LN患者Fen1基因61563142～61563342目的片段中未发现碱基变异,尚需要扩大样本量,或进行该基因的全基因组关联研究进一步证实Fen1基因在LN中的作用。

瓣状内切核酸酶1基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建瓣状内切核酸酶1(Flap endonuclease 1,FEN1)基因重组真核表达质粒,并进行鉴定。方法提取L02细胞总RNA,逆转录合成cDNA,经巢式PCR扩增FEN1基因,定向克隆至载体pcDNA3.1,构建重组真核表达质粒,经酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的真核表达质粒转染293T细胞,Western blot检测FEN1蛋白的表达。结果 FEN1基因重组真核表达质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;在相对分子质量约47 000处可见目的蛋白条带,转染细胞中FEN1蛋白表达量较空载体转染组及空白细胞对照组提高约3倍。结论已成功构建了FEN1基因重组真核表达质粒,并可在293T细胞中过表达FEN1。

瓣状内切核酸酶1与肿瘤

瓣状内切核酸酶1(flap endonuclease 1,FEN1)是一种结构特异性核酸酶,由一个核心结构域和一条尾链组成。FEN1在DNA修复过程中冈崎片段成熟时RNA引物的切除,长片段碱基切除修复中瓣状结构的切除等过程中发挥着重要作用。FEN1与不同的蛋白质相互作用,在不同的DNA复制和修复途径中发挥着重要作用。FEN1在肿瘤中有着异常的表达,这表明它可能是一种潜在的肿瘤标记物。