基于微小RNA-135b-5p靶向调控瓣状核酸内切酶1探究姜黄素对人卵巢癌细胞顺铂耐药的改善机制

目的 基于微小RNA-135b-5p(miR-135b-5p)靶向调控瓣状核酸内切酶1(FEN1)探究姜黄素对人卵巢癌细胞顺铂耐药的改善机制。方法 取对数生长期人卵巢癌顺铂耐药细胞株OVCAR-3/DDP,将细胞分为对照组、顺铂组、姜黄素组、顺铂+姜黄素组、顺铂+姜黄素+阴性对照抑制剂组、顺铂+姜黄素+miR-135b-5p抑制剂组、顺铂+姜黄素+miR-135b-5p模拟物组。对照组不予处理,其余各组分别予顺铂和/或姜黄素,后3组细胞采用脂质体转染法分别转染绿色荧光蛋白质粒(pGFP)-阴性对照抑制剂、pGFP-miR-135b-5p抑制剂、pGFP-miR-135b-5p模拟物载体。各组给药处理72 h后,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组细胞miR-135b-5p及FEN1 mRNA表达量;蛋白质印迹法检测各组细胞FEN1蛋白表达;双荧光素酶靶标实验验证miR-135b-5p与FEN1之间的作用关系;噻唑盐比色法检测各组细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果 姜黄素组、顺铂+姜黄素组、顺铂+姜黄素+阴性对照抑制剂组、顺铂+姜黄素+miR-135b-5p抑制剂组、顺铂+姜黄素+miR-135b-5p模拟物组miR-135b-5p表达量、增殖抑制率及细胞凋亡率均高于对照组和顺铂组,FEN1 mRNA及蛋白表达量均低于对照组和顺铂组(均P<0.05)。脂质体转染的3组中,顺铂+姜黄素+miR-135b-5p抑制剂组miR-135b-5p表达量、增殖抑制率及细胞凋亡率最低[(0.75±0.10)、(34.399±6.055)%、(17.3±3.1)%],FEN1 mRNA和蛋白表达量最高[(0.77±0.11)、(0.69±0.09)];顺铂+姜黄素+miR-135b-5p模拟物组miR-135b-5p表达量、增殖抑制率及细胞凋亡率最高[(1.68±0.26)、(80.365±10.617)%、(48.7±8.4)%],FEN1 mRNA和蛋白表达量最低[(0.33±0.04)、(0.29±0.04)](均P<0.05)。双荧光素酶靶标实验提示miR-135b-5p靶向FEN1。结论 姜黄素可增强OVCAR-3/DDP对顺铂的敏感性,可能与促进miR-135b-5p的表达从而靶向抑制FEN1的表达相关。

姜黄素通过降低miR-135b-5p和FEN1表达增强卵巢癌OVCAR-3细胞顺铂敏感性

目的:探究姜黄素对卵巢癌OVCAR-3细胞顺铂敏感性的影响及其潜在机制。方法:(1)体外常规培养卵巢癌亲本细胞OVCAR-3并构建顺铂耐药OVCAR-3/DDP细胞,将OVCAR-3细胞分为Control(常规培养)、DDP-1(1μmol/L顺铂)、DDP-5(5μmol/L顺铂)、DDP-10(10μmol/L顺铂)、DDP-15(15μmol/L顺铂)、DDP-20(20μmol/L顺铂)、DDP-30(30μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-1(20μmol/L姜黄素+1μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-5(20μmol/L姜黄素+5μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-10(20μmol/L姜黄素+10μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-15(20μmol/L姜黄素+15μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-20(20μmol/L姜黄素+20μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-30组(20μmol/L姜黄素+30μmol/L顺铂);将OVCAR-3/DDP细胞分为Control(常规处理)、DDP-10(10μmol/L顺铂)、DDP-20(20μmol/L顺铂)、DDP-30(30μmol/L顺铂)、DDP-40(40μmol/L顺铂)、DDP-50(50μmol/L顺铂)、DDP-60(60μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-10(20μmol/L姜黄素+10μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-20(20μmol/L姜黄素+20μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-30(20μmol/L姜黄素+30μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-40(20μmol/L姜黄素+40μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-50(20μmol/L姜黄素+50μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-60组(20μmol/L姜黄素+60μmol/L顺铂),CCK-8法检测细胞活性,计算顺铂半数抑制浓度(IC 50),筛选顺铂和姜黄素的合适作用浓度。(2)将OVCAR-3细胞分为对照组(常规处理)、DDP组(20.5μg/mL顺铂)、姜黄素组(20μmol/L姜黄素)、姜黄素+DDP组(20μmol/L姜黄素+20.5μg/mL顺铂);将OVCAR-3/DDP细胞分为对照组(常规处理)、DDP组(42.1μg/mL顺铂)、姜黄素组(20μmol/L姜黄素)、姜黄素+DDP组(20μmol/L姜黄素+42.1μg/mL顺铂),采用流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量(qRT)-PCR检测miR-135b-5p表达,qRT-PCR和免疫印迹法分别检测瓣状核酸内切酶-1(flap endonuclease 1,FEN1)mRNA和蛋白表达。结果:相同顺铂浓度时,与DDP组比较,姜黄素+DDP联合组OVCAR-3和OVCAR-3/DDP细胞活性明显降低(P均<0.001)。DDP作用于OVCAR-3和OVCAR-3/DDP细胞的IC 50分别为20.5μg/mL和42.1μg/mL。与OVCAR组或OVCAR/DDP组相较,姜黄素或顺铂致OVCAR-3和OVCAR-3/DDP细胞凋亡率明显增加(P均<0.001),两者联合作用时效果更显著。此外,姜黄素或顺铂处理可明显降低OVCAR-3和OVCAR-3/DDP细胞中miR-135b-5p表达及FEN1表达(P<0.01或<0.001),两者联合时效果更显著。结论:姜黄素可增强卵巢癌OVCAR-3细胞顺铂敏感性,其可能与降低miR-135b-5p和FEN1表达相关。

FEN1调节肝细胞癌发生和预后的临床意义

目的 分析瓣状核酸内切酶1(FEN1)与肝细胞癌(HCC)发生和预后的关系。方法 选取2017年5月至2022年10月我院肝胆外科收治的91例HCC患者的HCC组织(HCC组)和90例肝硬化患者的LC组织(LC组),采集所有患者术前血清样本。另纳入90例健康志愿者的血清样本作为对照。免疫组织化学法分析组织FEN1表达,酶联免疫吸附试验法检测血清FEN1水平。记录HCC患者5年无病生存期(DFS)和总生存期(OS)。结果 LC组和HCC组患者血清FEN1水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。HCC组织FEN1蛋白表达H评分与血清FEN1水平呈正相关(r_(s)=0.726,P<0.001)。血清FEN1诊断HCC或者鉴别诊断HCC和LC的曲线下面积(AUC)分别为0.943和0.897。血清FEN1水平>244.74 pg/mL为HCC患者5年DFS率和OS率的独立危险因素(P<0.05)。结论 FEN1在HCC组织和血清样本中过表达,并与HCC患者的不良预后呈正相关,可作为HCC患者的早期诊断和预后评估的生物标志物。

FEN1、GTF2IP23、KDM4A在乳腺癌组织中的表达研究

目的探讨瓣状核酸内切酶-1(FEN1)、转录因子Ⅱⅰ假基因23(GTF2IP23)、赖氨酸特异性去甲基化酶4A(KDM4A)在乳腺癌组织中的表达及相关性。方法选取2020年7月至2021年8月进行手术的女性乳腺癌患者72例及同期进行手术的乳腺良性肿瘤患者70例,收集乳腺癌患者手术切除癌组织、距癌组织5 cm癌旁组织标本及乳腺良性肿瘤患者肿瘤病理组织,连续切片后做免疫组化标记、进行免疫组化染色。反转录-实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测FEN1表达,Western blot法检测GTF2IP23、KDM4A表达,分析FEN1、GTF2IP23、KDM4A在乳腺癌组织中的表达相关性及联合检测对乳腺癌患者预后的预测价值。结果与癌旁组织相比,良性肿瘤组织、乳腺癌组织中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表达较高(P<0.05);乳腺癌组织中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表达高于癌旁组织(P<0.05)。乳腺癌组织中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表达与年龄、肿瘤直径、病理分期、淋巴结转移、脉管侵犯、分化情况密切相关(P<0.05)。乳腺癌组织中FEN1与GTF2IP23、KDM4A表达呈正相关(r=0.404、0.553,均P=0.001);GTF2IP23与KDM4A表达也呈正相关(r=0.582,P=0.001)。与FEN1、GTF2IP23、KDM4A单项检测相比,三项联合检测对乳腺癌患者预后预测的灵敏度提高,特异度降低;FEN1、GTF2IP23、KDM4A的曲线下面积(AUC)分别为0.691、0.659、0.708(P<0.05)。结论FEN1、GTF2IP23、KDM4A在乳腺癌组织中呈高表达,三者具有相关性,同时与乳腺癌患者病理特征密切相关,能够较好预测乳腺癌患者的预后,为临床诊断及治疗乳腺癌提供理论依据。

程序性翻译后修饰对FEN1功能调控的研究进展

瓣状核酸内切酶(FEN1)是结构特异性5′核酸酶超家族成员,以参与冈崎片段成熟、DNA重组、细胞凋亡DNA片段化和长片段碱基切除修复(LP-BER)而闻名,在生物体的多种代谢途径中发挥作用,对维持不同物种基因组的稳定性发挥着十分重要的作用。FEN1的功能或表达异常会导致生物体内的多个生命过程发生紊乱,如突变率增加、微卫星序列不稳定、DNA降解等,对生物体造成严重危害。因此,FEN1在生物体内的表达必须受到严格、精确、及时的调控。研究表明,翻译后修饰对FEN1蛋白的活性强弱、细胞定位及功能稳定性发挥着重要的调控作用。本文对关于FEN1翻译后修饰调控的相关研究进展进行总结,系统归纳翻译后修饰对FEN1功能的调控和影响,为后续开展FEN1程序性调控研究提供了参考。

FEN1在口腔癌相关成纤维细胞中的表达及其与PCNA的关系

目的检测瓣状核酸内切酶1(flap endonuclease-1,FEN1)及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在口腔癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)中的表达水平,并分析两者表达水平的相关性。方法选取新鲜的口腔鳞状细胞癌组织块和因口腔颌面部整形手术切除的正常口腔黏膜组织块,采用组织块贴壁法培养原代口腔CAFs和正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)并行免疫细胞化学染色鉴定;并分成CAFs组和NFs组,分别采用Western blot和PCR检测口腔CAFs和NFs中FEN1、PCNA蛋白表达水平及m RNA水平,并对FEN1、PCNA的表达水平做相关性分析。结果成功培养并鉴定口腔CAFs和NFs各12株,FEN1、PCNA的m RNA和蛋白表达水平在口腔CAFs组均高于NFs组,但差异均无统计学意义(P>0.05);在口腔CAFs中,FEN1与PCNA在m RNA水平呈正向的强相关性(r=0.677,P=0.016),而两者的蛋白表达水平无相关性(P>0.05)。结论在口腔CAFs中FEN1和PCNA的m RNA和蛋白表达水平与NFs组相比均无统计学差异,但CAFs中的FEN1与PCNA二者在m RNA水平呈正向强相关,两种基因在口腔CAFs中的相互关系及调节机制尚需进一步研究。

基于生物信息数据库分析FEN1基因在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的通过分析生物信息数据库相关资料,探讨瓣状核酸内切酶1(FEN1)基因在乳腺癌中的表达及其临床意义。方法检索Oncomine数据库,分析FEN1基因在不同类型肿瘤中的表达情况;检索基因表达谱动态分析(GEPIA)数据库,对比乳腺癌组织与正常乳腺组织之间FEN1基因的表达差异,分析该基因的表达水平与乳腺癌临床病理分期的关系;检索人类蛋白质图谱(HPA)数据库,可视化乳腺癌组织与正常乳腺组织FEN1基因的差异表达情况;利用Kaplan-Meier Plotter在线分析FEN1基因表达水平与乳腺癌患者预后的关系;检索肿瘤单细胞(CancerSEA)数据库分析FEN1基因与乳腺癌单个细胞功能状态的相关性。结果FEN1在多种肿瘤组织中高表达。与正常乳腺组织相比,乳腺癌组织中FEN1基因的表达明显升高(P<0.05),且不同临床病理分期乳腺癌患者FEN1基因表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。从总体来看,FEN1基因高表达组总生存率低于低表达组(P<0.05)。此外,FEN1基因的表达与乳腺癌多种细胞功能状态相关,其中与乳腺癌细胞的细胞周期、DNA损伤、DNA修复正相关性最高。结论FEN1基因在乳腺癌组织中呈高表达,与患者预后相关,并且与乳腺癌细胞功能存在一定相关性,可为临床乳腺癌的治疗及基因靶向药物的研制提供重要的理论依据。

火球菌Pyrococcus furious瓣状核酸内切酶1的表达纯化及酶学特征

【目的】克隆表达和纯化火球菌Pyrococcus furious来源的瓣状核酸内切酶1基因pFEN1(PF1414),对该蛋白的活性和酶学特征进行鉴定和分析。【方法】将pFEN1在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的荧光标记的寡核苷酸片段作为底物,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定pFEN1在体外的酶学特性以及与其他蛋白的相互作用。【结果】pFEN1重组蛋白能在大肠杆菌中进行高效表达;高于100 mmol/L的NaCl会抑制pFEN1的活性;pFEN1的核酸酶活性依赖于金属离子Mg^(2+)或Mn^(2+),且Mn^(2+)的催化效率优于Mg^(2+);来自嗜热古菌的pFEN1是一种耐高温蛋白,最适反应温度为60–65°C;增殖细胞核抗原(PCNA)能促进pFEN1的内切酶活性。【结论】本研究证实pFEN1是一种Mg^(2+)或Mn^(2+)依赖的核酸内切酶,且PCNA能促进该酶的活性。

FEN1、miR-215-5p在宫颈脱落细胞中的表达及其临床诊断价值

目的探讨瓣状核酸内切酶1(FEN1)、微小RNA-215-5p(miR-215-5p)在宫颈脱落细胞中的表达水平,并对其临床诊断进行分析。方法前瞻性选取2017年5月至2019年5月在辽宁电力中心医院进行液基薄层细胞学检查(TCT)的236例患者作为研究对象,并根据TCT结果进行分组:正常宫颈或慢性宫颈炎56例(对照组),宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ级组73例,CINⅡ级组57例,CINⅢ级组28例,宫颈癌组22例。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测宫颈脱落细胞中FEN1 mRNA、miR-215-5p表达水平;免疫印迹(WB)法检测宫颈脱落细胞中FEN1蛋白水平;Pearson法分析宫颈脱落细胞中FEN1 mRNA、miR-215-5p表达的相关性;ROC曲线分析宫颈脱落细胞中FEN1 mRNA、miR-215-5p表达水平对宫颈癌的诊断价值。结果对照组、CINⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级组宫颈脱落细胞中FEN1 mRNA和FEN1蛋白表达水平依次升高,miR-215-5p表达水平依次降低(均P<0.05);CINⅢ级组与宫颈癌组宫颈脱落细胞中FEN1 mRNA、FEN1蛋白和miR-215-5p表达水平比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。miR-215-5p与FEN1 mRNA水平呈负相关(r=-0.696,P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,以宫颈脱落细胞中FEN1 mRNA、miR-215-5p水平诊断宫颈癌的曲线下面积(AUC)分别为0.850(95%CI:0.785~0.914)、0.845(95%CI:0.778~0.912);二者联合检测诊断宫颈癌的AUC为0.861(95%CI:0.798~0.923)。结论CIN及宫颈癌患者宫颈脱落细胞中FEN1 mRNA和FEN1蛋白表达水平升高,miR-215-5p表达水平降低,与CIN及宫颈癌的发生密切相关,可能作为潜在的诊断标志物。

FEN1 siRNA对胃癌细胞生物学特性的影响及机制研究

目的 探讨瓣状核酸内切酶1（FEN1）小干扰RNA（FEN1 siRNA）对胃癌细胞生物学特性的影响及机制.方法 培养胃癌细胞SGC7901,转染FEN1 siRNA和阴性对照序列（siRNA control）分别命名为干扰组和NC组,同时以不做处理的胃癌细胞SGC7901作为对照组.采用实时荧光定量PCR和Western blot检测FEN1 siRNA的转染效果,细胞划痕实验检测胃癌细胞SGC7901迁移能力,Transwell小室检测胃癌细胞的侵袭能力,Western blot检测胃癌细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、β-连环蛋白（β-catenin）的蛋白相对表达水平.结果 干扰组细胞中FEN1 mRNA和蛋白水平明显低于对照组及NC组,差异均有统计学意义（P值均〈0.01）,而NC组细胞中FEN1 mRNA和蛋白水平与对照组比较,差异均无统计学意义（P值均〉0.05）.干扰组细胞迁移能力、侵袭能力及MMP-2、MMP-9、β-catenin蛋白相对表达水平均明显低于对照组及NC组,差异均有统计学意义（P值均〈0.01）;而NC组细胞迁移能力、侵袭能力及MMP-2、MMP-9、β-catenin蛋白相对表达水平与对照组比较,差异均无统计学意义（P值均〉0.05）.结论 转染FEN1 siRNA能够抑制胃癌细胞中FEN1的表达,可抑制胃癌细胞的迁移能力、侵袭能力,其作用机制可能与抑制MMP-2、MMP-9、β-catenin蛋白的表达水平有关.