甘松挥发油对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流的影响

目的研究甘松挥发油对大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流(Transient outward potassium current,Ito)的影响,探讨甘松挥发油抗心律失常作用的离子机制。方法用急性酶解分离法获得单个大鼠心室肌细胞,采用标准的全细胞膜片钳技术记录大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流(Ito)。结果甘松挥发油可呈浓度依赖性和电压依赖性抑制Ito。在+70mV时,3μg/g,6μg/g,10μg/g和20μg/g甘松挥发油分别抑制Ito峰值电流的抑制率为(27.01±6.93)%(n=5),(51.13±9.82)%(n=5),(80.86±4.63)%(n=5)和(94.81±4.30)%(n=5)。甘松挥发油对Ito的电流密度-电压关系曲线(current density-voltage curve,I-V曲线)的影响:在+70 mV时,6μg/g甘松挥发油使Ito峰电流从(23.081±0.74)pA/pF减少到(11.232±1.47)pA/pF(n=5,P<0.05),给药后电流密度减少约50%,给药前后电流密度变化有统计学意义。甘松挥发油对Ito激活和失活曲线的影响:在甘松挥发油6μg/g灌流法给药后,激活曲线显示给药前后半数激活电压(V1/2)为:(36.063±1.792)mV vs(34.788±3.029)mV(P>0.05,n=5);斜率因子(S)为:(22.972±1.491)mV vs(30.791±2.899)mV(P<0.05,n=5)。给药前后半数激活电压变化无显著差异。失活曲线显示甘松挥发油使失活曲线明显左移,差异有显著统计学意义:给药前后半数失活电压(V1/2)为(-33.738±0.476)mV vs(-40.536±0.696)mV(n=5,P<0.01);斜率因子(S)为:(5.001±0.396)mV vs(8.420±0.620)mV(n=5,P<0.01)。结论甘松挥发油可呈浓度和电压依赖性抑制大鼠心室肌细胞Ito,使I-V曲线下移,但对激活曲线无明显影响,同时,使失活曲线明显左移,使心室肌细胞复极化减慢,这可能是其抗心律失常作用的重要机制之一。

甘松挥发油对大鼠心室肌细胞Ik和Ik1的影响

目的研究甘松挥发油对大鼠心室肌细胞膜延迟整流钾电流(delayed rectifier K+current,Ik)和内向整流钾电流(inward rectifier K+current,Ik1)的影响,探讨甘松挥发油抗心律失常作用的离子机制。方法用急性酶解分离法获得单个大鼠心室肌细胞,采用标准的全细胞膜片钳技术记录大鼠心室肌细胞膜延迟整钾钾电流(Ik)和内向整流钾电流(Ik1)。结果 (1)浓度为1,3,5,10,20μg/g甘松挥发油可浓度依赖性地抑制Ik,使Ik+的电流密度-电压关系曲线(current den-sity-voltage curve,I-V曲线)下移,但激活电位,失活电位及翻转电位无影响。在-90 mV时,5μg/g甘松挥发油使Ik峰电流在给药后电流密度减小约45%,甘松挥发油对Ik激活和失活曲线的影响:甘松挥发油使激活曲线右移,给药前后半数失活电压(V1/2):(23.65±0.65)mV vs(28.19±0.57)mV(P<0.05,n=6),使失活曲线左移,给药前后V1/2:(-64.46±1.02)mVvs(-82.84±1.27)mV(n=6,P<0.05);(2)浓度为1,3,5,10,20,50μg/g甘松挥发油可浓度依赖性地抑制Ik1。在-60 mV时,5μg/g甘松挥发油使Ik1峰电流在给药后电流密度减小约50%。结论 (1)甘松挥发油可呈浓度依赖性抑制大鼠心室肌细胞Ik,使I-V曲线下移,使激活曲线右移、失活曲线左移;(2)甘松挥发油可呈浓度依赖性抑制大鼠心室肌细胞Ik1。甘松挥发油对两者的效应可使心肌细胞复极化减慢,这可能是其抗心律失常作用的重要机制之一。

中药甘松挥发油对HEK细胞Na_v1.5电流电压及电导电压的影响

目的应用膜片钳技术研究HEK细胞Nav1.5电流电压依赖性Na+电流失活与激活曲线,甘松挥发油对电流-电压关系(I-V),电导-电压关系(G-V)曲线的影响,以及对快Na+通道失活(H-I)的影响。方法应用膜片钳技术研究HEK细胞Nav1.5电压依赖性Na+电流失活曲线,I-V和H-I曲线。结果正常自然依赖性失活曲线向超极化移位,移动速度10 min内是4 mV。甘松挥发油能降低I-V曲线Na电流的峰电位,但不能改变其Na电位(ENa)从内流向外流的反转电位的方向。G-V曲线明显向超极化方面移动,Vg1/2=(-59.8±4.22)mV是对照自然失活曲线;Vg1/2=(-58.8±5.69)mV是10 PPM甘松挥发油;Vg1/2=(-68.0±4.36)mV是药物被洗脱后失活曲线(P<0.01,n=6)。在除去自然移动值后10 PPM甘松挥发油的Na电位失活作用明显。甘松挥发油应用前,应用10 PPM甘松挥发油以及药物洗脱后H-I曲线与自然失活曲线比较,校正自然失活因素后10 PPM甘松挥发油实际移动Vg1/2是(18.0±4.50)mV(P<0.01,n=5),洗脱40min后接近对照状态。结论甘松挥发油对I-V,G-V曲线有向超极化移位的影响。对快Na+通道有加速失活与抑制激活的作用,然而电压依赖性Na失活是可逆性的。这一作用奠定了甘松挥发油抗心律失常的作用机制。

甘松挥发油浸润和吸入法对大鼠心室肌有效不应期的影响

目的研究甘松挥发油不同途径给药对心肌有效不应期(ERP)的影响,探讨其抗心律失常作用及电生理机制。方法Wistar大鼠50只,体重(250±50)g,分为心外膜局部浸润(局部)(20只)和气道吸入组(吸入)(20只),给予1∶20000甘松挥发油。对照组(10例)。测定心室ERP,ERP/RR比值评价药物的影响。结果①局部吸入组对ERP/RR比值的影响:用药后ERP/RR比值与各相应对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),结果与ERP相似。②ERP、ERP/RR比值之间比较:在15、30、45min时间段,用ERP观察比较两种给药方式之间差异无统计学意义(P>0.05),但用ERP/RR比值比较两者,两种给药方式之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论①甘松挥发油局部、吸入可明显延长心室肌ERP。②用药后15～45min之间效果明显且稳定,45min后作用明显减弱。③ERP/RR比值能更准确的反应药物对有效不应期的作用。④吸入较局部浸润更加有效。

中药甘松挥发油对HEK细胞Na_v1.5电流频率依赖性阻滞的影响

目的研究中药甘松挥发油对HEK细胞Nav1.5电流频率依赖性阻滞的影响。方法用Nav1.5细胞,采取膜片钳技术直接记录甘松挥发油(VONCB)对HEK细胞Nav1.5电流频率依赖性阻滞。结果 VONCB对HEK细胞表达的鼠心肌Na+通道的具有阻滞作用。5 ppm VONCB在-100 mV电压钳制下,导致20%Na+电流抑制,静息状态产生轻微阻滞;VONCB对Na+通道抑制随刺激频率增加(1～20 Hz)而增加,产生明显的Na+通道频率依赖性阻滞。结论 VONCB对HEK细胞表达的Nav1.5通道的具有频率依性阻滞作用,VONCB对Na+通道抑制随刺激频率增加(1～20 Hz)而增加。

甘松挥发油对大鼠心肌缺血再灌注损伤及磷脂酰肌醇3激酶通路的影响

目的探讨甘松挥发油对大鼠心肌缺血再灌注损伤及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路的的影响。方法将80只SD大鼠随机分成5组,即假手术组(n=10)、心肌缺血再灌注(IR)组(n=20)、高剂量甘松挥发油(HD)组(n=20)、低剂量甘松挥发油(LD)组(n=20)、二甲基亚砜(DMSO)组(n=10)。观察各组大鼠心肌梗死面积、心肌损伤标记物、心率、血压变化,以及PI3K通路蛋白表达情况。结果高剂量甘松挥发油组大鼠心肌梗死面积、血肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)和心肌肌钙蛋白(cTnT)表达均显著小于IR模型组(P<0.05),同时高剂量甘松挥发油组Akt/磷酸化Akt(p-Akt)、GSK-3β/磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、eNOS/磷酸化eNOS(p-eNOS)蛋白表达显著高于IR模型组(P<0.05)。结论甘松挥发油后处理大鼠心肌缺血再灌注能显著减轻心肌损伤,其保护机制可能与PI3K-AKT通路激活有关。

不同时点应用甘松挥发油对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

目的:观察不同时点应用甘松挥发油对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法:将SD大鼠40只随机分成4组,每组10只:(1)假手术组;(2)心肌缺血再灌注(I/R)组;(3)甘松挥发油-1组;(4)甘松挥发油-2组。分别观察各组大鼠心肌梗死面积、血清CK-MB和cTnT水平,以及血清IL-6和TNF-α含量;并使用心电图记录再灌注期间室性早搏频数和室速持续时间。结果:甘松挥发油-1组和甘松挥发油-2组中心肌梗死面积、CK-MB、cTnT、IL-6、TNF-α均明显小于I/R模型(P均<0.05),其中甘松挥发油-1组中心肌梗死面积、CK-MB、cTnT、IL-6、TNF-α均明显小于甘松挥发油-2组(P<0.05)。结论:在大鼠心肌缺血再灌注前使用甘松挥发油进行干预能显著减轻心肌损伤,其机制可能与甘松挥发油具有钙通道阻滞剂作用、抑制炎症反应、延长心肌细胞有效不应期有关。

甘松挥发油β-环糊精包合物的制备

目的:研究饱和溶液法包合甘松挥发油的最佳工艺。方法:采用正交试验,以挥发油的利用率及包合物收得率为考察指标进行综合评分,优选包合工艺;使用TLC,UV,IR,扫描电镜,GC-MS等分析方法对包合效果进行评价。结果:最佳包合条件为挥发油-β-环糊精1∶6,包合温度40℃,包合时间1 h,搅拌速度300 r.min-1;包合物形成一种新的物相,且包合前后挥发油组成有一定的变化。结论:实验得出的最佳包合工艺操作简便,挥发油利用率和包合率较高。

HEK细胞Nav1.5电流对甘松挥发油浓度及电压依赖性阻滞

目的:研究甘松挥发油对人肾胚胎(HEK)细胞Nav1.5电流的影响。方法:应用细胞膜片钳技术研究甘松挥发油对鼠cDNA编码组成的纯钠通道在人胚胎肾细胞(HEK)表达的Nav1.5细胞离子通道电流的影响。结果:发现甘松挥发油对Na电流的阻滞作用受挥发油浓度影响,量-效反应量呈"S"曲线型,电压钳制影响表现为膜电位越低(电位上移)阻滞作用越强。结论:甘松挥发油对钠电位有明显阻滞作用,其作用随剂量增加而增加,随膜电位降低而作用加强。提示临床可用于因心肌缺血导致膜电位降低而诱发的心律失常。

基于指纹图谱法对不同炮制方式下甘松的化学成分差异分析

目的建立甘松挥发油指纹图谱,对不同炮制方式的甘松进行质量评价,为甘松的炮制方式提供参考。方法收集10批次甘松,不同炮制方法处理后,水蒸气蒸馏法提取挥发油。气相色谱法(GC)建立指纹图谱,并采用高分辨质谱对共有峰成分进行鉴定,再以聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)法进行分析,找出3种炮制方式下的主要差异成分。结果建立了甘松挥发油去土处理、水洗晾干、水洗烘干的GC指纹图谱,共标定18个共有峰,采用化学计量学分析方法可以对不同炮制方式的甘松进行有效区分,高分辨气质联用技术对共有峰成分进行指认,发现不同的炮制方式会对甘松中白菖烯,喇叭烯氯化物-(Ⅱ),百秋李醇,(-)-马兜铃烯等成分影响显著。结论本实验所建立的甘松挥发油指纹图谱方法精密度、重复性、稳定性良好,且各峰分离度较高,结合化学计量学模式发现不同的炮制方式会对甘松质量产生较大影响,可以为甘松的炮制方式与质量控制提供参考和依据。