甘氨脱氧胆酸盐诱导HL-7702凋亡及细胞内Ca^2＋浓度变化

目的观察甘氨脱氧胆酸盐（GCDC）对体外培养的人正常肝细胞株HL-7702的凋亡诱导作用及在凋亡过程中细胞内Ca2＋浓度的变化,探讨GCDC致肝细胞损伤的机制。方法以GCDC为处理因素,体外培养HL-7702细胞,普通光学显微镜观察细胞形态变化,Annexin Ⅴ-EGFP/PI双染色法检测细胞凋亡率,荧光染料Fluo-3/AM负载技术检测细胞内Ca2＋浓度的变化。结果GCDC作用于HL-7702细胞后,细胞形态呈现凋亡特征,细胞的凋亡率、细胞内Ca2＋浓度与GCDC呈剂量及时间依赖性。结论GCDC能诱导体外培养的HL-7702细胞凋亡,细胞内Ca2＋浓度的变化是诱导细胞凋亡的机制之一。

甘氨脱氧胆酸对人肝癌细胞增殖抑制与诱导凋亡的实验研究

目的探讨甘氨脱氧胆酸（GDCA）对人肝癌细胞SMMC7721增殖的影响以及细胞凋亡作用。方法采用96孔细胞培养板体外培养人肝癌细胞株SMMC7721，在24、48、96h后加入GDCA，并进行四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验，计算肝癌细胞的生长抑制率；采用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的影响。结果GDCA对肝癌细胞SMMC7721有增殖抑制作用，GDCA作用细胞72h后，200、400、800／μmo／L GDCA抑制率分别为18．18％、29．94％和88．54％；细胞周期分析显示，G1期细胞比例与对照组相比明显升高，GDCA200、400／μmol／L处理组P〈0．05，S期有不同程度的下降，GDCA400／μmol／L处理组P〈0．01。Annexin V-FITC检测结果显示GDCA 200、400μmol／L处理组48和72h后细胞凋亡比例比对照组明显增加，差异具有统计学意义。结论GDCA对人肝癌细胞有增殖抑制作用，并能诱导SMMC7721细胞凋亡。

p53、Bcl-2、Bax在甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞HL-7702细胞凋亡机制中的作用

目的观察p53、bcl-2、bax在甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞HL-7702细胞凋亡中的表达,并探讨其凋亡机制。方法终浓度分别为100、150、200、250μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h,AnnexinV-FITC/PI双染色法检测GCDC诱导HL-7702细胞凋亡的凋亡率,RT-PCR测定p53、bcl-2、bax基因mRNA表达水平。结果 100、150、200、250μmol/L的GCDC均可诱导HL-7702细胞凋亡,呈剂量依赖性,凋亡率分别为(13.16±2.9)%(t=6.41),(20.3±3.0)%(t=10.22),(25.02±2.1)%(t=18.11),(45.02±3.5)%(t=28.89),较对照组(2.2±0.6)%显著升高(P<0.05);GCDC使细胞内bcl-2 mRNA的表达下降、p53和bax mRNA的表达增加。结论 p53、Bcl-2、Bax在甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞HL-7702细胞凋亡中发挥重要作用。

甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞株HL-7702凋亡过程中caspase3,9活性与mRNA表达水平变化

目的观察甘氨脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate,GCDC)诱导人正常肝细胞株HL-7702凋亡过程中caspase3,9活性与mRNA表达的变化,探讨GCDC诱导肝细胞凋亡的机制。方法体外培养HL-7702细胞,不同浓度的GCDC为处理因素,用Annexin V-FITC/PI双染色法结合流式细胞技术仪检测细胞凋亡率,比色法测定caspase3,9活性,RT-PCR检测caspase3,9mRNA表达水平。结果100μM^250μM的GCDC处理HL-7702细胞24h后,其细胞凋亡率、caspase3,9活性与mRNA表达水平明显升高,并与GCDC呈浓度依赖性。结论caspase3,9参与GCDC诱导HL-7702细胞凋亡调控,GCDC通过活化caspase9,进一步活化caspase3诱导肝细胞凋亡。

甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞株HL-7702凋亡过程中caspase-3,8活性与mRNA表达水平变化

目的:观察甘氨脱氧胆酸盐(Glycodeoxycholate,GCDC)诱导人正常肝细胞株HL-7702凋亡过程中caspase-3,8活性与mRNA表达水平的变化,探讨GCDC诱导肝细胞凋亡的机制。方法:体外培养HL-7702细胞,不同浓度的GCDC为处理因素,用AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法结合流式细胞技术仪检测细胞凋亡率,比色法测定caspase-3,8活性,RT-PCR检测caspase-3,8mRNA表达水平。结果:100～250μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24 h后,其细胞凋亡率、caspase-3,8活性与mRNA表达水平明显升高,并与GCDC呈浓度依赖性。结论:caspase-3,8参与GCDC诱导HL-7702细胞凋亡的调控,GCDC通过活化caspase-8,并进一步活化caspase-3从而诱导肝细胞凋亡。

甘氨脱氧胆酸钠对人肝癌细胞周期及P21mRNA表达的影响

目的:探讨甘氨脱氧胆酸钠(glycodeoxrycholic acid,GDCA)作用人肝癌细胞SMMC7721后对细胞周期及P21mRNA表达的影响。方法:流式细胞仪对细胞周期进行检测;Trizol提取细胞RNA,然后进行RT-PCR。结果:GD-CA100、200、400μmol/L处理组均对SMMC7721的细胞周期具有阻滞作用,主要表现为G1期的延长,S期缩短。P21mRNA的表达明显上调。结论:GDCA对SMMC7721的细胞周期具有明显阻滞作用,并能下调P21mRNA的表达。

甘氨脱氧胆酸对肝细胞钙激活性钾通道的影响

目的 观察甘氨脱氧胆酸 (GDC)对大鼠肝细胞钙激活性钾通道 (KCa)开放概率的影响。方法 体外培养大鼠肝细胞 ,以 GDC为处理因素 ,应用膜片钳技术通过贴附式和内面向外式膜片测定大鼠 KCa开放概率。结果 1细胞贴附式膜片下 ,浴液中 Ca2 +浓度 10 - 7mol/ L,GDC终浓度为 5 0 ,10 0 ,2 5 0 μmol/ L 时 ,概率由 0 .0 38± 0 .0 9分别增加到 0 .6 2 0±0 .338,0 .5 91± 0 .16 3,0 .895± 0 .176 (n=4,P均 <0 .0 1)。浴液中不加 GDC,改变 Ca2 +浓度 (10 - 7、10 - 6、10 - 5 mol/ L) ,KCa的开放概率并不发生明显改变 ,而在此液中加入 GDC(终浓度 10 0 μmol/ L) ,KCa开放概率由 0 .0 42± 0 .0 15增加到 0 .385±0 .330和 0 .5 5 1± 0 .16 3(n=4,P均 <0 .0 5 )。浴液中不含 Ca2 + ,并加入 EGTA,GDC浓度为 5 0 ,10 0 ,2 5 0 μmol/ L,KCa开放概率显著增加 (n=4,P均 <0 .0 5 ) ,但比浴液中有 Ca2 + 时增加程度小。 2内面向外式膜片下 ,浴液中无 Ca2 + ,加入 GDC(10 ,5 0 ,10 0 ,2 5 0μmol/ L ) ,KCa开放概率无明显改变 (n=2 ,P>0 .0 5 )。结论 1GDC对 KCa有明显的激活作用 ,并有浓度依赖性。 2 GDC既有引起胞外 Ca2 +内流 ,也能诱导内贮 Ca2 +的释放。 3GDC对 KCa的激活是通过 Ca2 +实现的。

甘氨脱氧胆酸钠对人肝癌细胞端粒酶活性及其hTERTmRNA表达的影响

目的探讨甘氨脱氧胆酸钠(glycodeoxycholic acid,GDCA)对肝癌SMMC7721细胞端粒酶活性以及hTERTmRNA表达影响。方法采用PCR-ELISA法检测端粒酶活性;应用RT-PCR检测hTERTmRNA的表达。结果GDCA作用肝癌SMMC7721细胞后,端粒酶活性与hTERTmRNA表达均降低,GDCA200、400μmol/L处理组与对照组端粒酶活性(A450nmOD值)分别为(0.140±0.04)、(0.077±0.01)、(0.248±0.05),差异有统计学意义(P<0.05),抑制率为43.5%和69.0%。hTERTmRNA表达明显降低,相对表达率分别为1.33、0.59、1.89。结论甘氨脱氧胆酸钠抑制肝癌SMMC7721细胞端粒酶活性,且下调hTERTmRNA的表达。

甘氨脱氧胆酸对肝细胞膜流动性及脂质过氧化的作用研究

目的 研究甘氨脱氧胆酸(GDCA)对肝细胞脂质过氧化及细胞膜流动性的影响,探讨GDCA 肝损伤机理。方法 以 GDCA 为处理因素,体外培养肝细胞。结果 终浓度为250μmol/L 时,GDCA 组培养1～4小时,肝细胞 MDA 含量显著增加(P<0.001),细胞膜流动性显著降低(P<0.02)。随着丙二醛(MDA)的增加和细胞膜流动性的降低,肝细胞释放 ALT 增加,r 分别是0.945和0.986。结论 GDCA 能引起肝细胞 MDA 增加和膜流动性降低,从而导致肝细胞损伤,从新的角度解释了 GDCA 的肝损伤机理。

甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞HL-7702凋亡及其机制的研究

目的观察甘氨脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate,GCDC)对人正常肝细胞株HL-7702凋亡的影响,并探讨其凋亡机制。方法终浓度分别为100、150、200、250μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h,光学显微镜观察GCDC对HL-7702细胞形态的影响,AnnexinV-FITC/PI双染色法检测HL-7702细胞的凋亡率,用荧光指示剂Fluo-3/AM测定HL-7702细胞内钙离子浓度,RT-PCR测定Bcl-2、Bax基因mRNA表达水平。结果终浓度为150μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h后,细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变;100、150、200、250μmol/L的GCDC均可诱导HL-7702细胞凋亡,呈剂量依赖性,凋亡率分别为(13.16±2.9)%(t=6.41)、(20.3±3.0)%(t=10.22)、(25.02±2.1)%(t=18.11)、(45.02±3.5)%(t=28.89),较对照组(2.2±0.6)%显著升高(P<0.05);GCDC能使HL-7702细胞内钙离子浓度增加,且具有浓度依赖性;GCDC使细胞内Bcl-2mRNA的表达下降、BaxmRNA的表达增加。结论GCDC可能是通过增加HL-7702细胞内钙离子浓度,并进一步下调Bcl-2、上调Bax表达水平,从而诱导细胞凋亡。

甘氨脱氧胆酸对肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶的影响

目的 :观察甘氨脱氧胆酸 (GDCA)对肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH -PX)的影响 ,探讨GDCA对肝细胞过氧化脂质作用的机理。方法 :体外培养肝细胞 ,以GDCA为处理因素 ,测定肝细胞GSH -PX谷胱甘肽过氧化物酶活力。结果 :GDCA终浓度分别为 5 0、 10 0、 15 0、 2 0 0、 2 5 0 μmol/L ,培养 3小时 ,GSH -PX活力分别为( X±SD ,n =4) :2 2 0 0± (t=0 2 45 ) ,2 0 17± 0 5 9(t=4 47) ,17 5± 0 86 (t=8 475 ) ,14 6 0± 0 5 8(t=16 73) ,12 5 2± 0 95 (t=16 83)。GDCA终浓度 15 0 μmol/L ,分别 1、 2、 3、 4小时 ,GSH -PX活力分别为 ( X±SD ,n =4) :2 2 40± 0 6 5 (t=0 945 ) ,2 0 30± 0 47(t=3 35 9) ,17 5 8± 1 15 (t=6 72 2 ) ,14 40± 0 86 (t=12 33)。结论 :GD CA能使GSH -PX活力下降 ,并对浓度和培养时间有依赖性。

甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞株HL-7702凋亡过程中caspase-3,8,9蛋白活性变化及凋亡机制研究

目的观察甘氨脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate,GCDC)诱导人正常肝细胞株HL-7702凋亡过程中caspase-3,8,9活性的变化,探讨其凋亡机制。方法体外培养HL-7702细胞,以GCDC为处理因素,用AnnexinV-FITC/PI双染色法结合流式细胞技术仪检测细胞凋亡率,比色法测定caspase-3,8,9活性。结果100、150、200、250μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h后以及250μmol/LGCDC处理细胞4、8、12、24h后,其细胞凋亡率、caspase-3,8,9活性明显升高,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论GCDC可通过活化caspase-8,9,进而激活caspase-3从而诱导肝细胞凋亡。

荷载雷公藤红素的甘氨脱氧胆酸钠/DSPE-mPEG 2000仿生混合胶束体内外抗前列腺肿瘤研究

目的:制备荷载雷公藤红素的甘氨脱氧胆酸钠/DSPE-mPEG 2000仿生混合胶束(C-mM),评价其体内外抗前列腺肿瘤作用。方法:采用"溶解-滴注-透析"法制备仿生胶束,以载体摩尔比例(甘氨脱氧胆酸钠/DSPE-mPEG 2000)、投药量、纯水用量及透析时间为考察因素优化其制备工艺,以形态学、粒径、Zeta电位、稳定性和包封率为指标表征其理化性质;体外以PC-3(人源前列腺肿瘤)细胞为模型,采用MTT法和AnnexinV-PE/7-AAD试剂盒分别考察C-mM抗增殖和促凋亡作用;体内通过皮下接种PC-3细胞建立异位前列腺肿瘤裸鼠模型,检测C-mM的抑瘤率、荷瘤小鼠的瘤重、体质量、肝脾功能、生存时间等指标。结果:C-mM的最佳工艺为:甘氨脱氧胆酸钠与DSPE-mPEG 2000的摩尔比值为3∶1,投药量7.5 mg(相对应的DSPE-mPEG 2000为2.5 mg),纯水用量10 mL,透析时间6 h。C-mM呈球状,粒径为(100.10±4.38)nm,Zeta电位为-(17.92±2.43)mV,包封率为(79.46±2.7)%,且具有较好的稳定性。C-mM对PC-3细胞的IC_(50)和凋亡诱导率分别为(5.32±0.46)μg/mL和(70.42±5.66)%,均显著优于雷公藤红素(P<0.01)。经C-mM灌胃治疗14 d后,裸鼠的肿瘤抑瘤率为(75.00±6.26)%,中位生存时间为43 d,体质量、肝脾指数等均未出现明显异常。结论:C-mM体内外均有显著地抗前列腺肿瘤作用,且未见明显的毒副作用,有望作为口服纳米载药系统用于前列腺肿瘤的治疗。

甘氨脱氧胆酸钠胶束对Ca^2＋离子的“缓冲”作用及其机理

采用浊度滴定、激光光散射谱、透射电子显微镜和傅里叶变换红外光谱等方法研究了甘氨脱氧胆酸钠(NaGDC)胶束对Ca2+的"缓冲"作用及其机理。结果表明,NaGDC浓度在CMC以上时,将延缓甘氨脱氧胆酸钙盐的沉淀,浓度越高"缓冲"能力越大。可能的作用机理是当NaGDC浓度小于CMC时,Ca2+直接与GDC-离子作用,形成甘氨脱氧胆酸钙沉淀;当NaGDC浓度大于CMC时,首先,Ca2+与NaGDC胶束亲水面上的羧基作用,使NaGDC小胶束通过Ca2+桥连接形成纤维状的大胶束。而后,随着Ca2+浓度的增加,纤维状胶束中与Ca2+作用的COO-逐渐增多,当胶束中Ca2+/Na+比增大到一定值时,最终形成NanCam(GDC)n+2m沉淀,从而延缓了甘氨脱氧胆酸钙盐的生成。为研究胆汁中表面活性与金属离子的复杂相互作用给出了新思路。

甘氨脱氧胆酸诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡中对P53表达的影响

目的探讨甘氨脱氧胆酸(GDCA)在诱导SMMC-7721细胞凋亡中对P53表达的影响。方法用膜联蛋白V(annexinV)检测细胞凋亡,RT-PCR分析p53 mRNA变化,免疫组化技术分析P53蛋白表达。结果GDCA可明显诱导SMMC-7721细胞凋亡,具有明显的时间和剂量依赖。200μmol/L GDCA处理组在48 h和72 h的细胞凋亡率分别为(7.67±2.35)%、(12.93±1.48)%;400μmol/L GDCA处理组则分别为(13.14±2.56)%、(14.22±2.11)%。GDCA可明显提高p53 mRNA水平,且较强地抑制突变的P53蛋白的表达。结论GDCA具有诱导SMMC-7721细胞凋亡作用。

甘氨脱氧胆酸对肝细胞膜流动性及脂质过氧化的作用研究

研究甘氨脱氧胆酸（ＧＤＣＡ）对肝细胞脂质过氧化及细胞膜流动性的影响，探讨ＧＤＣＡ肝损伤机理。方法以ＧＤＣＡ为处理因素，体外培养肝细胞。结果终浓度为２５０μｍｏｌ／Ｌ时，ＧＤＣＡ组培养１～４小时，肝细胞ＭＤＡ含量显著增加（Ｐ＜０００１），细胞膜流动性显著降低（Ｐ＜０．０２）。随着丙二醛（ＭＤＡ）的增加和细胞膜流动性的降低，肝细胞释放ＡＬＴ增加，ｒ分别是０．９４５和０９８６。结论ＧＤＣＡ能引起肝细胞ＭＤＡ增加和膜流动性降低，从而导致肝细胞损伤，从新的角度解释了ＧＤＣＡ的肝损伤机理。

甘氨脱氧胆酸诱导大鼠肝细胞凋亡

目的探讨甘氨脱氧胆酸（Glycodeoxycholate，GDC）与大鼠肝细胞凋亡的关系。方法以GDC为处理因素，体外培养大鼠原代肝细胞，分别用光镜、电镜、TUNEL原位杂交，流式细胞术和DNA电泳技术观察和分析GDC诱导大鼠肝细胞凋亡的作用。结果大鼠肝细胞在加入终浓度为100μmol／L的GDC培养2h后，光镜、电镜、TUNEL原位杂交，可见凋亡细胞。终浓度为50、100、150μmol／L培养2h，及终浓度为100μmol／LGDC分别培养2、4、6、8hDNA电泳均可见典型Ladder图谱。结论GDC浓度为50，100，150μmol／L能诱导大鼠肝细胞凋亡。

两种不同方法检测血清中甘氨鹅脱氧胆酸钠的对比分析

本文探讨生化法与高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测血清中甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)结果的相关性。根据美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)EP9-A文件,每天取临床样本8份,分别采用自主研发的体外诊断生化试剂和HPLC-MS/MS测定血清GCDC含量,共测定5d,记录结果,去除离群点,计算线性回归方程和相关系数,进行偏倚估计,对比生化试剂测量的准确性。通过试验得出生化法和HPLC-MS/MS方法检测血清GCDC的相关方程为Y生化法=0.9642XHPLC-MS/MS-1.2266,相关系数(r)=0.9954,两种方法结果高度相关,有很好的可比性;两种血清中GCDC检测结果具有很好的可比性,由于检测原理和仪器不同,当采用不同方法时,应对其进行对比分析和偏倚评估。

甘氨鹅脱氧胆酸盐对人正常肝细胞HL-7702的影响

目的观察甘氨鹅脱氧胆酸盐(glycochenodeoxcholate,GCDC)对人正常肝细胞HL-7702凋亡诱导作用,探讨GCDC诱导HL-7702细胞凋亡的机制。方法终浓度分别为50、100、150、200、250μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞4、8、12、24h,光学显微镜镜下观察细胞形态学改变、用Am-Blue细胞活性检测和乳酸脱氢酶活性的测定及AnnexinV-FITC/PI双染色法检测GCDC对HL-7702细胞凋亡的影响,用荧光指示剂Fluo-3/AM测定HL-7702细胞内钙离子浓度。结果 (1)终浓度为150μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h后,细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变,包括核固缩、核碎裂和凋亡小体形成等。(2)Am-Blue吸光光度法、GENMED乳酸脱氢酶(LDH)总活性比色法及AnnexinV-FITC/PI双染色法定量检测结果均显示,GCDC均可诱导HL-7702细胞凋亡且呈剂量及时间依赖性。(3)GCDC能使HL-7702细胞内钙离子浓度增加且具有浓度和时间依赖性。结论 GCDC可能通过增加HL-7702细胞内钙离子浓度诱导人正常肝细胞HL-7702凋亡,其作用具有浓度和时间依赖性。