中国对虾甘氨酸脱羧酶的基因克隆、表达及其与抗WSSV的关联分析

本研究采用RACE技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)甘氨酸脱羧酶基因(Fc GLDC)的全长cDNA及DNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,FcGLDC基因的cDNA全长为3481 bp,其中,ORF为2829 bp,5￠UTR长17 bp,3￠UTR长86 bp。完整的阅读框编码942个氨基酸,分子量为104.66 kDa,预测的理论等电点为6.51。FcGLDC基因DNA序列全长共4964bp,包含12个外显子和11个内含子。同源性及系统进化分析显示,FcGLDC基因与节肢动物的GLDC基因聚为一类;氨基酸序列比对发现,Fc GLDC基因的蛋白序列与节肢动物的相似度最高,与内华达白蚁(Zootermopsis nevadensis)、体虱(Pediculus humanus corporis)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)的相似度分别为71%、68%和68%。在鳃、肝胰腺和肌肉中的荧光定量PCR结果显示,FcGLDC在肌肉中的相对表达量最高,鳃中最低。WSSV感染后,该基因在鳃、肝胰腺和肌肉中呈现出了不同的时空表达特点。使用直接测序法结合质谱法,在该基因内部发现4个SNP位点,但是各位点与抗WSSV性状均不相关(P>0.05)。本研究表明,FcGLDC基因在对虾感染WSSV后的应答反应中或起一定作用。

甘氨酸脱羧酶基因增强子区(-4.2^-2.2 kb)基因图谱绘制及其活性检测

目的绘制鸡甘氨酸脱羧酶基因的增强子(-4. 2^-2. 2 kb)区域图谱并检测其活性。方法利用多种限制性内切酶绘制甘氨酸脱羧酶基因的增强子区域,构建甘氨酸脱羧酶截断体的荧光素酶报告基因,瞬时转染肝癌细胞HepG2检测荧光素酶活性。结果 GDC基因5’端上游-4200^-2200区域含有KpnⅠ;HincⅡ;EcoRⅠ;HindⅢ;PstⅠ;XbaⅠ限制性内切酶识别位点;荧光素酶报告基因检测发现KX全长和HDHI/L,HIK两种截短体活性明显高于空载体,其余截短体活性无明显变化或降低。结论 GDC基因5’-端区域-4200/-2200基因片段具有抑制或激活GDC启动子活性的能力。

紫花苜蓿甘氨酸脱羧酶H-蛋白基因MsGDC-H1功能分析

光呼吸通过清除2-磷酸乙醇酸(2-PG)使氧合光合作用成为可能,该过程对C3植物至关重要。H-蛋白是光呼吸过程中将甘氨酸转化为丝氨酸的甘氨酸脱羧酶(GDC)的关键组成蛋白之一。本研究克隆了紫花苜蓿MsGDCH1,该基因编码166个氨基酸,具有1个硫辛酰基附着位点保守结构域和1个N6-硫辛酰赖氨酸保守位点。进化分析表明,MsGDC-H1蛋白与双子叶植物的甘氨酸脱羧酶H-蛋白(GDC-H)亲缘关系近。表达模式分析表明,MsGDC-H1在苜蓿叶中表达丰度高,且受光诱导。为了探究MsGDC-H1基因对拟南芥生长的影响,分别使用光诱导的茎叶特异性启动子ST-LS1和组成型启动子CaMV 35S驱动MsGDC-H1(ST-LS1::MsGDC-H1;CaMV35S::MsGDC-H1)在拟南芥中异源表达。检测过表达植株生物量、淀粉、可溶性糖含量以及光合速率。数据分析显示,CaMV 35S::MsGDC-H1过表达拟南芥(G系列植株)生长受阻,淀粉含量比ST-LS1::MsGDC-H1特异性表达拟南芥(GS系列植株)增加了34%~67%,比野生型(WT)增加了7。3%~33。7%;可溶性糖含量比GS系列降低了36%~38%,比WT增加了44。3%~49。7%;与WT相比,GS系列植株生长更快,淀粉含量无显著差异(P>0。05),可溶性糖含量显著增加(P<0。05)。试验结果表明,MsGDC-H1基因在调控拟南芥光合速率、碳水化合物合成以及生长等方面发挥重要作用,未来可作为提高苜蓿产量的基因工程育种候选基因。

C_3-C_4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P-蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将 Ｃ３－Ｃ４中间型植物 Ｆｌａｖｅｒｉａ ａｎｏｍａｌａ中甘氨酸脱羧酶（ＧＤＣ）Ｐ－蛋白亚基基因（ｇｄｃｓＰ）的上游调控 序列与β－葡萄糖苷酸酶（ＧＵＳ）基因编码区以及ＣａＭＶ终止子融合，构建植物表达载体．采用农杆菌介导 方法转化水稻，并在转基因水稻中分析了ＧＵＳ的表达活性和特异性．结果表明，在水稻中ｇｕｓ嵌合基因 特异地在木质部和韧皮部表达，在不同器官及组织中表达活性也有所差异，其中以根中最高，茎秆次 之，叶再次，而在成熟胚乳中没有表达．在转基因水稻中，ｇｄｃｓＰ启动子的表达也受水稻发育时期的调 控，随植物组织成熟度的增加而降低．

p53基因变异的B细胞淋巴瘤小鼠甘氨酸脱羧酶表达研究

目的了解p53基因变异和B细胞淋巴瘤甘氨酸脱羧酶(GLDC)表达的关系。方法基于免疫组化染色结果,BALB/c裸鼠分为p53蛋白阳性组和p53蛋白阴性组。采用实时荧光定量PCR检测B细胞淋巴瘤组织甘氨酸脱羧酶m RNA表达,采用免疫印迹实验检测B细胞淋巴瘤组织甘氨酸脱羧酶蛋白表达。设计GLDC特异性siRNA转染人B淋巴瘤细胞系Raji细胞。采用t检验比较GLDC mRNA和GLDC蛋白表达组间的差异,并采用方差分析比较阴性对照siRNA组、空白对照组和GLDC siRNA转染组增殖能力的差异。结果相对于p53蛋白阴性组,p53蛋白阳性组GLDC mRNA和蛋白表达都升高,GLDC mRNA表达在p53蛋白阴性组为2.38±0.26,在p53蛋白阳性组升高到11.32±1.65,差异具有统计学意义(t=6.74,P <0.01)。相对于阴性对照siRNA组(0.61±0.06)和空白对照组(0.51±0.04),GLDC siRNA转染组(0.22±0.01)细胞增殖能力明显降低,差异具有统计学意义(t=3.74,P <0.05),结论 p53基因变异和B细胞淋巴瘤GLDC表达有直接的关系。GLDC基因能促进p53基因变异B细胞淋巴瘤增殖。GLDC的研究可能为治疗B细胞淋巴瘤提供新的靶点。

重组甘氨酸脱羧酶基因工程菌生产L-5-甲基四氢叶酸

目的:针对叶酸代谢通路中的甘氨酸脱氢酶(GDC)构建高效表达GDC的重组菌E.coli BL21(pET22b-gcvP)并检测L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)的增加量。方法:采用PCR法获得GDC基因gcvP,分别在其两端加上HindⅢ和XhoⅠ酶切位点,经HindⅢ和XhoⅠ双酶切后,连接到经同样双酶切的表达载体pET22b中,经限制性内切酶酶切和测序验证正确后,转化至E.coli BL21中。乳糖诱导重组蛋白表达,进行SDS-PAGE电泳,HPLC检测L-5-MTHF产量。结果:经双酶切与测序鉴定证实原核重组载体pET22b-gcvP构建成功,表达产物相对分子质量约为104×103,与GDC大小相符。与原始菌相比,重组菌的L-5-MTHF的产量增加了23.1%。结论:重组甘氨酸脱羧酶基因工程菌能够提高L-5-MTHF产量。

胃癌组织GLDC蛋白表达及其与根治术后复发的关系探讨

目的:探讨胃癌组织中甘氨酸脱羧酶(GLDC)蛋白的表达及其与根治术后复发的关系。方法:选取在本院行根治术治疗的胃癌患者106例,检测并比较胃癌组织与切缘正常组织中GLDC蛋白的表达水平,分析GLDC蛋白表达与临床病理特征的关系。患者行根治术后随访3年,根据随访期内是否复发分复发组与未复发组,比较2组胃癌组织GLDC蛋白表达情况,采用Cox回归分析根治术后复发的影响因素,并采用Kaplan-Meier生存曲线分析胃癌组织GLDC蛋白不同表达水平患者的复发率。结果:胃癌组织GLDC蛋白低表达率高于切缘正常组织(P<0.05),肿瘤直径≥5 cm、lauren分型为弥漫型、T3~T4分期、N1~N3分期患者中癌组织GLDC蛋白表达水平更低(P<0.05)。胃癌根治术后3年复发率为65.05%,复发组肿瘤直径≥5 cm、T3~T4分期、N1~N3分期、胃癌组织GLDC蛋白低表达占比均高于未复发组(P<0.05),行术后辅助化疗占比低于未复发组(P<0.05),均为胃癌患者根治术后复发的影响因素(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,GLDC蛋白低表达组的复发率高于高表达组(P<0.05)。结论:胃癌组织中GLDC蛋白表达水平降低,与肿瘤大小、组织学分型、T分期、N分期均有关,胃癌根治术后复发率高,胃癌组织GLDC蛋白表达水平可影响患者根治术后的复发率。