甘氨鹅脱氧胆酸钠通过MAPK/ERK1/2介导Bcl-2在Ser70位点的磷酸化引起人肝细胞癌的抗药

B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)是一种重要的抗凋亡蛋白质,在多种人类肿瘤中普遍过表达。甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDA)与消化道肿瘤的发生发展密切相关,并能介导肝癌细胞对化疗药物的抵抗。本文旨在探讨在GCDA介导的人肝细胞癌(HCC)耐药性中Bcl-2的作用及其机制。本研究以肝癌细胞系为研究对象,Western印迹结果显示,Bcl-2在多种肝癌细胞系中均有表达。设计靶向Bcl-2的siRNA沉默HCC细胞系内源性Bcl-2的表达,发现Bcl-2沉默之后促进了化疗药物5-FU介导的HCC细胞凋亡。机制上,GCDA可介导Bcl-2在Ser70位点的磷酸化,而Ser70位点的磷酸化能够被PD98059(MAPK/ERK1/2抑制剂)所抑制。构建huBcl2-WT和huBcl2-S70A真核表达载体,脂质体转染HCC细胞系。用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测凋亡细胞。结果显示,huBcl2-WT过表达能抑制5-FU介导的凋亡,S70位点失活突变成A后,Bcl-2的过表达不能抑制5-FU介导的凋亡。本研究提示,GCDA通过MAPK/ERK1/2通路介导的Bcl-2 Ser70位点的磷酸化,在肝癌细胞的存活和抗药中发挥重要作用。抑制Bcl-2能够促进化疗药物5-FU介导的HCC细胞凋亡,该结果为治疗GCDA介导的耐药性肝癌提供新的思路。

PI3K/AKT/mTOR信号通路对甘氨鹅脱氧胆酸钠诱导的肝细胞凋亡的机制研究

目的:探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路对甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)诱导的人肝正常细胞HL-7702增殖、凋亡的影响。方法:将HL-7702细胞分为对照组、GCDC组(1 mmol/L的GCDC预处理细胞4 h)、GCDC+LY294002组(GCDC处理细胞4 h后,使用15μmol/L的LY294002处理细胞24 h)和GCDC+IGF-1组(GCDC处理细胞4 h后,使用20 nmol/L的IGF-1处理细胞24 h)。处理结束后,通过Western blot检测PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Bcl-2、Bax和Nrf2蛋白表达;MTT法及Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞增殖和凋亡率;DCFH-DA探针法检测细胞活性氧(ROS)含量。结果:GCDC可明显下调HL-7702细胞PI3K、p-AKT、p-mTOR、Bcl-2和Nrf2表达,上调Bax表达,抑制细胞增殖,诱导凋亡,诱导细胞ROS产生(P<0.05),LY294002可增强GCDC对HL-7702细胞增殖、凋亡、ROS水平及PI3K、p-AKT、p-mTOR、Bcl-2、Bax和Nrf2表达影响,IGF-1反之。结论:激活PI3K/AKT/mTOR信号通路可改善胆汁性肝纤维化,机制可能与抗凋亡和抗氧化有关。

甘氨鹅脱氧胆酸钠致阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中bcl-2 mRNA的表达意义

目的:探讨bcl-2基因在阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中的调控作用。 方法:健康(?)Wistar大鼠,进腹,游离出胆总管,于肝门部结扎胆总管并切断,远端再予以结扎。进腹后不结扎切断胆总管作为阴性对照。结扎后3,7,14,21d处死大鼠,每组8只。采用胶原酶原位肝灌注法获取体外培养正常大鼠及阻塞性黄疸大鼠肝细胞。分别收取正常大鼠及胆总管结扎大鼠肝细胞1×10~9/L^(-1),用Trizol试剂盒一步法提取大鼠肝细胞总RNA,行RT-PCR扩增;用PCR扩增bcl-2,和对照β-actin基因片段;分离的正常大鼠及胆总管结扎14 d大鼠的肝细胞行原代培养,培养板内置小飞片,使用100μmol·L^(-1)甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)作用于两组肝细胞24h后,用FCM法分析肝细胞的凋亡比率,用TUNEL技术进行肝细胞凋亡的原位检测。 结果:体外培养正常大鼠及结扎3d大鼠肝细胞bcl-2 mRNA的表达为阴性,仅见β-actin条带;胆总管结扎大鼠体外培养肝细胞在结扎后7d即可见肝细胞内bcl-2 mRNA的表达,其吸光度A值为0.13±0.15;结扎后14、21d也可检测其表达,bcl-2 mRNA吸光度在结扎14d达高峰,为0.56±0.21,且与结扎7、21d相比,两者差异有显著性(P<0.05);100μmol·L^(-1)的GCDC作用正常大鼠肝细胞后,凋亡明显增加,凋亡率为34.9±2.9％;

甘氨鹅脱氧胆酸钠对肝癌SMMC7721细胞凋亡诱导的影响

目的探讨甘氨鹅脱氧胆酸（glycochenodeoxycholic cacid，OCDCA）对人肝癌细胞SMMC7721增殖以及细胞凋亡的影响。方法采用96孔细胞培养板体外培养人肝癌细胞株SMMC7721，GCDCA分别处理细胞24，48，72h，进行MTT实验，计算肝癌细胞的生长抑制率；采用流式细胞仪检测GCDCA对SMMC7721细胞凋亡的影响。结果不同浓度的GCDCA对肝癌细胞SMMC7721均有一定程度的生长抑制作用，高浓度的GCDCA（300μmol／L）处理组对SMMC7721细胞有较强的毒性损伤。低浓度的GCDCA（200μmol／L）处理组能明显诱导细胞凋亡，凋亡率随处理时问的延长而增加。结论GCDCA对人肝癌细胞有增殖抑制作用并能诱导SMMC7721细胞凋亡。

果糖在甘氨鹅脱氧胆酸钠致体外培养大鼠肝细胞凋亡中的保护作用

为探索阻塞性黄疸肝损害的机制及果糖的保护作用 ,采用胶原酶原位肝灌注法获取大鼠肝细胞 ,行原代培养 ,以不同浓度甘氨鹅脱氧胆酸钠 (GCDC)作用肝细胞 2 4h后 ,用 FCM法分析肝细胞的凋亡比率 ,用 TUNEL 技术进行肝细胞凋亡的原位检测 ;用不同浓度果糖 (Fructose)作用于肝细胞 ,10 0 μmol/ L 的 GCDC作用后行 FCM及 TUNEL检测。结果显示 GCDC可致肝细胞凋亡 ,且随 GCDC浓度的增加肝细胞的凋亡比率明显增加。经果糖作用后 ,10 0 μmol/L 的 GCDC致肝细胞的凋亡率明显减少 ,且随果糖作用浓度的增加肝细胞凋亡率减少。提示胆盐致肝细胞凋亡 ,可能是阻塞性黄疸肝损害的机制 ;果糖在 GCDC致大鼠肝细胞凋亡中起保护作用。

胆汁淤积性微环境中甘氨鹅脱氧胆酸钠促进肝脏干细胞凋亡

目的探讨在胆汁淤积性肝硬化病理微环境下对肝脏干细胞存活率的影响及体外甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)对肝脏干细胞凋亡的影响。方法以Balb/c小鼠胆总管结扎模型模拟胆汁淤积性肝硬化的病理环境并回输肝脏干细胞HP14-19,检测细胞定植存活情况;通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)、结晶紫染色检测甘氨鹅脱氧胆酸钠对增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,通过Western blotting检测凋亡标志物Bax、Bcl-2、Caspase-3表达和磷酸化腺嘌呤核苷二磷酸依赖性蛋白激酶α(p-AMPKα)、腺嘌呤核苷二磷酸依赖性蛋白激酶α(AMPKα)等的表达。结果通过CCK-8检测和结晶紫染色发现,随着甘氨鹅脱氧胆酸钠作用浓度的增加,HP14-19细胞的增殖抑制;流式细胞术提示,GCDC处理组细胞凋亡率明显增加(P<0. 05);Western blotting检测发现,与对照组相比,实验组凋亡基因Bax、Caspase-3蛋白表达上调,抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达下调,AMPKα活化增加(P<0. 05)。结论胆汁淤积性肝硬化所导致的胆汁淤积微环境诱导肝脏干细胞发生凋亡。

甘氨脱氧胆酸钠对人肝癌细胞周期及P21mRNA表达的影响

目的:探讨甘氨脱氧胆酸钠(glycodeoxrycholic acid,GDCA)作用人肝癌细胞SMMC7721后对细胞周期及P21mRNA表达的影响。方法:流式细胞仪对细胞周期进行检测;Trizol提取细胞RNA,然后进行RT-PCR。结果:GD-CA100、200、400μmol/L处理组均对SMMC7721的细胞周期具有阻滞作用,主要表现为G1期的延长,S期缩短。P21mRNA的表达明显上调。结论:GDCA对SMMC7721的细胞周期具有明显阻滞作用,并能下调P21mRNA的表达。

甘氨脱氧胆酸钠对人肝癌细胞端粒酶活性及其hTERTmRNA表达的影响

目的探讨甘氨脱氧胆酸钠(glycodeoxycholic acid,GDCA)对肝癌SMMC7721细胞端粒酶活性以及hTERTmRNA表达影响。方法采用PCR-ELISA法检测端粒酶活性;应用RT-PCR检测hTERTmRNA的表达。结果GDCA作用肝癌SMMC7721细胞后,端粒酶活性与hTERTmRNA表达均降低,GDCA200、400μmol/L处理组与对照组端粒酶活性(A450nmOD值)分别为(0.140±0.04)、(0.077±0.01)、(0.248±0.05),差异有统计学意义(P<0.05),抑制率为43.5%和69.0%。hTERTmRNA表达明显降低,相对表达率分别为1.33、0.59、1.89。结论甘氨脱氧胆酸钠抑制肝癌SMMC7721细胞端粒酶活性,且下调hTERTmRNA的表达。

两种不同方法检测血清中甘氨鹅脱氧胆酸钠的对比分析

本文探讨生化法与高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测血清中甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)结果的相关性。根据美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)EP9-A文件,每天取临床样本8份,分别采用自主研发的体外诊断生化试剂和HPLC-MS/MS测定血清GCDC含量,共测定5d,记录结果,去除离群点,计算线性回归方程和相关系数,进行偏倚估计,对比生化试剂测量的准确性。通过试验得出生化法和HPLC-MS/MS方法检测血清GCDC的相关方程为Y生化法=0.9642XHPLC-MS/MS-1.2266,相关系数(r)=0.9954,两种方法结果高度相关,有很好的可比性;两种血清中GCDC检测结果具有很好的可比性,由于检测原理和仪器不同,当采用不同方法时,应对其进行对比分析和偏倚评估。

荷载雷公藤红素的甘氨脱氧胆酸钠/DSPE-mPEG 2000仿生混合胶束体内外抗前列腺肿瘤研究

目的:制备荷载雷公藤红素的甘氨脱氧胆酸钠/DSPE-mPEG 2000仿生混合胶束(C-mM),评价其体内外抗前列腺肿瘤作用。方法:采用"溶解-滴注-透析"法制备仿生胶束,以载体摩尔比例(甘氨脱氧胆酸钠/DSPE-mPEG 2000)、投药量、纯水用量及透析时间为考察因素优化其制备工艺,以形态学、粒径、Zeta电位、稳定性和包封率为指标表征其理化性质;体外以PC-3(人源前列腺肿瘤)细胞为模型,采用MTT法和AnnexinV-PE/7-AAD试剂盒分别考察C-mM抗增殖和促凋亡作用;体内通过皮下接种PC-3细胞建立异位前列腺肿瘤裸鼠模型,检测C-mM的抑瘤率、荷瘤小鼠的瘤重、体质量、肝脾功能、生存时间等指标。结果:C-mM的最佳工艺为:甘氨脱氧胆酸钠与DSPE-mPEG 2000的摩尔比值为3∶1,投药量7.5 mg(相对应的DSPE-mPEG 2000为2.5 mg),纯水用量10 mL,透析时间6 h。C-mM呈球状,粒径为(100.10±4.38)nm,Zeta电位为-(17.92±2.43)mV,包封率为(79.46±2.7)%,且具有较好的稳定性。C-mM对PC-3细胞的IC_(50)和凋亡诱导率分别为(5.32±0.46)μg/mL和(70.42±5.66)%,均显著优于雷公藤红素(P<0.01)。经C-mM灌胃治疗14 d后,裸鼠的肿瘤抑瘤率为(75.00±6.26)%,中位生存时间为43 d,体质量、肝脾指数等均未出现明显异常。结论:C-mM体内外均有显著地抗前列腺肿瘤作用,且未见明显的毒副作用,有望作为口服纳米载药系统用于前列腺肿瘤的治疗。

甘氨脱氧胆酸钠胶束对Ca^2＋离子的“缓冲”作用及其机理

采用浊度滴定、激光光散射谱、透射电子显微镜和傅里叶变换红外光谱等方法研究了甘氨脱氧胆酸钠(NaGDC)胶束对Ca2+的"缓冲"作用及其机理。结果表明,NaGDC浓度在CMC以上时,将延缓甘氨脱氧胆酸钙盐的沉淀,浓度越高"缓冲"能力越大。可能的作用机理是当NaGDC浓度小于CMC时,Ca2+直接与GDC-离子作用,形成甘氨脱氧胆酸钙沉淀;当NaGDC浓度大于CMC时,首先,Ca2+与NaGDC胶束亲水面上的羧基作用,使NaGDC小胶束通过Ca2+桥连接形成纤维状的大胶束。而后,随着Ca2+浓度的增加,纤维状胶束中与Ca2+作用的COO-逐渐增多,当胶束中Ca2+/Na+比增大到一定值时,最终形成NanCam(GDC)n+2m沉淀,从而延缓了甘氨脱氧胆酸钙盐的生成。为研究胆汁中表面活性与金属离子的复杂相互作用给出了新思路。

甘氨鹅脱氧胆酸盐对人正常肝细胞HL-7702的影响

目的观察甘氨鹅脱氧胆酸盐(glycochenodeoxcholate,GCDC)对人正常肝细胞HL-7702凋亡诱导作用,探讨GCDC诱导HL-7702细胞凋亡的机制。方法终浓度分别为50、100、150、200、250μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞4、8、12、24h,光学显微镜镜下观察细胞形态学改变、用Am-Blue细胞活性检测和乳酸脱氢酶活性的测定及AnnexinV-FITC/PI双染色法检测GCDC对HL-7702细胞凋亡的影响,用荧光指示剂Fluo-3/AM测定HL-7702细胞内钙离子浓度。结果 (1)终浓度为150μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h后,细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变,包括核固缩、核碎裂和凋亡小体形成等。(2)Am-Blue吸光光度法、GENMED乳酸脱氢酶(LDH)总活性比色法及AnnexinV-FITC/PI双染色法定量检测结果均显示,GCDC均可诱导HL-7702细胞凋亡且呈剂量及时间依赖性。(3)GCDC能使HL-7702细胞内钙离子浓度增加且具有浓度和时间依赖性。结论 GCDC可能通过增加HL-7702细胞内钙离子浓度诱导人正常肝细胞HL-7702凋亡,其作用具有浓度和时间依赖性。

甘氨鹅脱氧胆酸诱导肺泡上皮细胞 A549自噬信号改变的实验研究

目的：探讨自噬/溶酶体凋亡信号在甘氨鹅脱氧胆酸（GCDC）处理的肺泡 II 型上皮细胞（AECII）中的变化及作用。方法甘氨鹅脱氧酶处理肺泡上皮 A549细胞后，检测自噬途径的标志蛋白LC3II浓度、细胞内钙浓度及溶酶体酶PH值。结果甘氨鹅脱氧胆酸抑制A549自噬启动蛋白LC3II的表达、增加A549胞内Ca2＋浓度、降低溶酶体功能。结论甘氨鹅脱氧胆酸会影响肺泡上皮细胞自噬相关蛋白表达，损伤溶酶体活性和通透性，可能导致细胞凋亡。

一氧化氮抑制甘氨鹅脱氧胆酸诱导A549细胞凋亡的实验研究

目的探讨一氧化氮对甘氨鹅脱氧胆酸诱导A549细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法成功建立胆甘氨鹅脱氧酸诱导A549细胞凋亡模型后,检测一氧化氮合酶的表达水平及一氧化氮供体对甘氨鹅脱氧胆酸诱导A549细胞凋亡的抑制作用。结果甘氨鹅脱氧胆酸可诱导A549细胞发生caspase-3依赖的细胞凋亡,凋亡过程中伴随有一氧化氮合酶表达抑制,一氧化氮供体能有效地减弱胆酸诱导的A549细胞凋亡。结论通过吸入一氧化氮可有效抑制甘氨鹅脱氧胆酸诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡。

甘氨鹅脱氧胆酸对体外细粒棘球蚴原头节活力及ROS影响

目的研究甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid,GCDCA)对体外细粒棘球蚴原头节活力及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平的影响。方法将细粒棘球蚴原头节分为对照组及GCDCA处理组(500、1 500、2 500μmol/L),应用体外培养技术,通过伊红染色法每天定时在光学显微镜下观察原头节的活力并记录存活和死亡数目。使用试剂盒检测不同浓度GCDCA处理24h后各组原头节体内caspase-3酶活性变化;DCFH-DA染色法荧光显微镜观察GCDCA作用24h后原头节内ROS水平变化。结果 500、1 500、2 500μmol/L GCDCA处理后均可导致原头节活力减弱,且最高浓度组在第7d时原头节全部死亡。500、1 500、2 500μmol/L GCDCA组作用原头节24h后caspase-3酶活性与对照组相比明显升高(F=555.162,P<0.05)。500、1 500、2 500μmol/L GCDCA作用原头节24h后原头节内ROS水平与对照组相比明显升高(F=216.901,P<0.05)。结论 GCDCA能抑制体外原头节生长,促使原头节死亡,可能与活化caspase-3及提高原头节内ROS水平相关,具体机制有待进一步研究。

胆盐(GCDA)对肝癌细胞凋亡及其药物敏感性的影响

目的探索胆盐(GCDA)环境下肝癌细胞株HepG2的生长情况及其对抗肿瘤药物的敏感性。方法用不同时间或浓度GCDA处理HepG2细胞,采用MTT法检测细胞活性与增殖性;用3种抗肿瘤药对HepG2细胞进行处理,采用流式细胞分析法检测GCDA存在与缺少时的细胞周期与凋亡。结果GCDA的处理浓度在200μM内对细胞有明显增殖作用(P<0.05);GCDA的处理时间在4h内对细胞有增殖作用,以10～20min最明显(P<0.05)。3种药物对肝癌HepG2细胞均有杀伤作用,阿霉素(ADM)对细胞周期的影响阻滞在G0/G1,Oxaplatin与Irinotecan阻滞在S期,GCDA使Irinotecan作用下细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。结论GCDA能诱导肝细胞癌细胞株HepG2细胞存活与增殖,GCDA对Irinotecan的药性有抵制作用,使肿瘤细胞对其的敏感性降低。

胆汁酸对胃癌细胞株MKN-28生长的影响

胆汁反流是常见现象，其对胃上皮细胞生长的影响尚不明确。目的：探讨胆汁酸体外对胃癌细胞株MKN-28生长的影响。方法：采用Mr丌法测定不同浓度牛磺石胆酸钠（TLC）和甘氨鹅脱氧胆酸钠（GCDC）对胃癌细胞株MKN．28生长的影响。结果：第1-6d，60-300μmol／LTLC可明显抑制MKN-28细胞生长，且呈剂量依赖性。300μmol／LGCDC干预24h可显著抑制MKN-28细胞生长。结论：脂溶性胆汁酸TLC和水溶性胆汁酸GCDC体外均可直接抑制胃癌细胞生长。

GCDCA对肝癌SMMC7721细胞诱导分化的影响

目的探讨甘氨鹅脱氧胆酸（glycodeoxycholicacid，GCDCA）对人肝癌细胞SMMC7721诱导分化的影响。方法采用96孔细胞培养板体外培养人肝癌细胞株SMMC7721，GCDCA分别处理细胞48，72，96h，采用放射免疫法检测肝癌sMMC7721细胞的甲胎蛋白（AFP）、清蛋白（ALB）分泌量，同时利用免疫组化分析肝癌SMMC7721细胞AFP表达的影响。结果GCDCA能显著抑制肝癌细胞SMMC7721AFP的分泌，降低其表达，且能大大提高ALB的分泌。其效果GCI）-CA200umol／L处理组优于GCDCA100umol／L处理组，均有时效和量效的关系。结论GCDCA能抑制肝癌SMMC7721细胞AFP的表达和分泌，提高ALB的分泌，具有诱导肝癌细胞SMMC7721细胞良性分化的能力。

Falk论坛胆汁酸专题讨论会速递

第203届Falk论坛暨第24届国际胆汁酸会议于2016年6月17至18日在德国杜塞尔多夫召开.此次会议的主题是“健康与疾病中的胆汁酸”,分为“肝脏再生与肿瘤形成中的胆汁酸信号”、“肝-肠轴中的胆汁酸信号”、“肝内胆汁酸信号转导与毒性”、胆汁酸转运体在健康和疾病中的作用”以及“作为治疗靶点的胆汁酸信号和胆汁酸转运体”五大话题,内容涵盖了目前为学界关注的胆汁酸相关的临床研究、基础理论及潜在转化医学靶点等多个层面的前沿进展,本文将分别就以上内容做-简介.