甘油醛-3-磷酸脱氢酶核转位与高糖应激诱导的H9c2细胞凋亡密切相关

目的:探讨高糖应激是否引起心肌细胞中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)核转位以及GAPDH核转位是否与细胞凋亡有关。方法:高糖培养H9c2细胞48 h后,收集细胞进行细胞凋亡的测定,用DCFH-DA荧光探针测定细胞中活性氧簇(ROS)的水平,用Western Blotting方法测定细胞质和细胞核中GAPDH以及细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,用细胞免疫荧光的方法测定GAPDH的核转位情况。结果:与低糖培养组相比,高糖培养组H9c2细胞凋亡率增高,ROS生成和iNOS表达增多,GAPDH由细胞质向细胞核转位;而线粒体呼吸链复合体I抑制剂鱼藤酮和iNOS抑制剂1400W均阻断GAP-DH的转位,并减少高糖诱导的H9c2细胞的凋亡。结论:高糖诱导H9c2细胞中GAPDH由细胞质向细胞核转位;鱼藤酮和1400W可抑制高糖Flavonoids诱导的细胞凋亡,这一作用与抑制GAPDH核转位有关。

刺五加甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的鉴定与分析

刺五加(Eleutherococcussenticosus)为我国名贵中药,甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)参与光合作用和能量代谢,可能对药用活性成分合成有着重要影响。为了深入理解刺五加的生物学机制,本研究使用ExPASy、TBtools、MEGA11和EasyCodeML等工具对刺五加的GAPDH基因家族进行鉴定和分析。共得到26条GAPDH基因,其编码蛋白普遍呈中性且具有较好的脂溶性,主要分布于细胞质和叶绿体。蛋白结构中,α螺旋占多数,推测其起主要作用。系统发育分析发现26条GAPDH基因可分为三大分支,基因结构中包含较多外显子,推测拥有更加丰富的多肽加工机制以实现不同的生物学功能。基因在染色体上均匀分布,共线性分析得到17个染色体间共线性基因对。压力选择分析显示相关基因受到负选择压力,保守基序高度相似,在进化过程中的高度保守。蛋白互作网络发现GAPDH与多个蛋白关系密切。这些结果揭示了GAPDH在刺五加光合作用、能量代谢和次生代谢等方面的重要性和功能多样性,为深入理解刺五加的生物学机制提供了有力支持。

罗非鱼源无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与原核表达

为对罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910株甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因进行克隆及表达进行研究,根据GenBank上已登录的相关基因设计引物,采用PCR方法扩增该株细菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因,然后将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。结果显示,甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因有1011个碱基,编码336个氨基酸;同源基因序列比对显示,无乳链球菌ZQ0910株与无乳链球菌2603V/R的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的同源性最高;经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后,SDS-PAGE电泳显示甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白表达的最优条件为:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.06mmol/L、温度37℃、诱导5h,蛋白表达量最大;HisTrap HP柱纯化后融合蛋白的质量浓度为560μg/mL;Western Blot验证甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子量为36.01ku。研究结果表明,成功克隆与表达了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因,这将为进一步研究甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫原性及亚单位疫苗提供理论依据。

刺激隐核虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子特征

从刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)滋养体/包囊前体c DNA文库中筛选出了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Ci GAPDH),定点诱变Ci GAPDH基因开放阅读框内的非通用密码子后,构建其原核表达载体p GEX-4T-3/Ci GAPDH,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基硫式-B-D-半乳糖苷诱导表达,结果大肠杆菌成功表达了r Ci GAPDH蛋白。用抗r Ci GAPDH蛋白的鼠血清进行免疫印迹分析,结果抗血清能够识别刺激隐核虫各期虫体的天然Ci GAPDH蛋白,其表观分子质量为37.3 ku,与根据氨基酸序列推算的理论值相符;实验表明r Ci GAPDH蛋白具有很好的免疫原性,而且Ci GAPDH在生活史的各阶段均有表达,符合持家基因的特征。利用间接免疫荧光抗体实验(IFAT)检测天然Ci GAPDH蛋白在刺激隐核虫幼虫上的定位,结果表明天然Ci GAPDH蛋白主要分布在幼虫的细胞质内,且在胞口位置分布最多。对Ci GAPDH的进一步研究可能为刺激隐核虫感染的药物靶点的寻找多条线索。

大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活动态监测

利用大肠杆菌原核表达系统高效表达大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶,并结合蛋白分离纯化技术获得高纯度样品,动态监测其酶活。通过RT-PCR技术,扩增PC12细胞中甘油醛3-磷酸脱氢酶编码序列并亚克隆到原核表达载体pET28b;鉴定正确后,转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞并采用诱导剂IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达,表达产物采用15% SDS-PAGE鉴定,用镍柱对蛋白进行纯化及脱盐;最后将分离纯化产物在体外进行甘油醛3-磷酸脱氢酶酶活动态分析。结果表明,成功构建大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶的原核表达载体pET28b-G3PDH;高效表达甘油醛3-磷酸脱氢酶,表达产物占总蛋白35%,且发现表达产物主要以可溶形式分布于裂解上清;制备甘油醛3-磷酸脱氢酶纯品并通过酶活动态扫描显示其具有高效酶活性。通过大肠杆菌原核表达技术高效制备具有重要酶活作用的大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶,为进一步研究其在糖代谢中的功能以及其可能的新功能奠定基础。

柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

从柽柳(Tamarix hispida)cDNA文库中分离出甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ThGAPDH)全长cDNA序列,该基因全长1294bp。其中:5′非翻译区84bp,3′非翻译区184bp,开放阅读框1206bp,编码含341个氨基酸的蛋白质,编码蛋白的相对分子质量为37200,理论等电点(pI)为6.97。采用实时定量RT-PCR方法研究了刚毛柽柳在PEG、NaCl、NaHCO3及CdCl2胁迫下不同时间该基因ThGAPDH的表达模式。结果表明:PEG、NaCl及CdCl2处理均能诱导ThGAPDH基因在根中的表达而抑制其在茎和叶中的表达,而NaHCO3处理均能诱导该基因在根、茎、叶中的表达。基因ThGAPDH的cDNA序列在GenBank中的登录号为GQ478708。

西伯利亚蓼甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆与序列分析

根据NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼茎部消减库中甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)表达序列标签序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增技术,从西伯利亚蓼茎中扩增出GAPDH的全长cDNA序列。该cDNA序列全长1331bp,完整阅读框1014bp,编码337个氨基酸。属于稳定蛋白,具有GAPDH保守功能域。氨基酸组成与其他已知高等植物来自细胞质中的GAPDH基因cDNA序列具有很高的同源性,最高可以达到96%。通过转酿酒酵母INVSC1的NaHCO3和NaCl胁迫试验表明,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)有明显的抗盐胁迫特性。在10%NaHCO3和4mol·L-1 NaCl胁迫下,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)菌株存活率明显比INVSC1(pYES2)高,可以推测GAPDH基因赋予INVSC1(pYES2-GAPDH)抗NaHCO3和NaCl的能力。该基因的cDNA序列在GenBank中登录号为DQ922680。

植物甘油醛-3-磷酸脱氢酶作用机制的研究进展

糖酵解、卡尔文循环是植物体供能和碳代谢的关键路径,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在其中发挥核心作用,近年的研究不断揭示其作用及其调控的多样性和复杂性。概述GAPDH的类型与作用,着重阐述GAPDH与NAD(P)互作的特异性,PRK/GAPDH/CP12复合体及其调节和逆境胁迫下GAPDH的应答及机理研究成果。

樟叶越桔甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因VdGAPDH1的cDNA克隆与序列分析

应用转录组测序分析和RT-PCR技术首次从樟叶越桔Vaccinium dunalianum中克隆了全长1 570 bp的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因Vd GAPDH1,其完整的开放阅读框推测编码由337个氨基酸残基组成的Vd GAPDH1。Vd GAPDH1理论相对分子量为36.57 k D,等电点为7.06,负电荷残基(Asp+Glu)总数为42个,正电荷残基(Arg+Lys)总数为42个,不稳定系数为23.27,属稳定性蛋白质;其二级结构主要由随机卷曲、延伸链、α-螺旋和β-转角等构件组成。Vd GAPDH1为无信号肽、无跨膜结构的亲水性蛋白质,推测其为NAD+-GAPDH的新成员,与已知细胞质型GAPDH之间存在高度保守性。Vd GAPDH1包含2个保守超家族结构域Gp_dh_N和Gp_dh_C,Gp_dh_N为辅酶NAD+结合结构域,Gp_dh_C是行使糖运输和代谢的催化功能域。推测Vd GAPDH1基因产物在樟叶越桔细胞质中参与糖酵解过程。该研究为后期Vd GAPDH1基因的生理功能及其表达调控等研究奠定了基础。

盐胁迫下盐穗木甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的表达与亚细胞定位分析

为研究盐胁迫下植物甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的作用机制,该研究利用RACE技术,从藜科盐生植物盐穗木中克隆获得1 381bp GAPDH基因(HcGAPDH)全长cDNA序列,其开放阅读框(ORF)编码314氨基酸。序列分析表明,HcGAPDH属于胞质GAPDH家族成员。实时定量PCR结果显示,HcGAPDH的转录水平受盐胁迫和ABA上调。通过荧光共聚焦显微技术,检测到绿色荧光蛋白标记的HcGAPDH在正常情况下定位于细胞质中,盐胁迫可促使其从细胞质转移至细胞核中,此过程与细胞内碳水化合物代谢的信号途径不具有相关性。研究表明,HcGAPDH通过细胞质和细胞核之间的信号传导在植物盐胁迫中发挥一定作用,为进一步揭示盐穗木耐盐分子机制奠定了一定基础。

球毛壳菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆及特性分析

用粗糙脉孢菌(Neurospora crassa,XP_327967)和菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianu,P35143)的甘油醛_3_磷酸脱氢酶基因(Glyceraldehyde 3_phosphatedehydrogenase,GAPDH)氨基酸序列对球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌丝ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了球毛壳菌GAPDH全长cDNA序列。该序列长1240bp,开放阅读框1014bp,编码337个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为36.1kD。用PCR方法克隆了该基因的DNA序列,序列长为1556bp,由2个内含子和3个外显子组成。BlastP同源性分析表明该基因与鹅掌柄孢壳(Podosporaanserine)同源性最高为95%;与米曲霉(Aspergillusoryzae)同源性最低为87%。GAPDH酵母转化子生物功能分析表明转化子对Na2CO3和高温有高的耐受性,证明GAPDH为抗胁迫基因。该基因的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY522719,AY593253,AAS01412)。

箭筈豌豆甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因片段的克隆及序列分析

本研究预期通过同源克隆获得了箭筈豌豆(Vicia sativa)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的部分片段,为研究箭筈豌豆适应高海拔环境的分子机制奠定基础。根据近缘物种GAPDH基因序列设计1对引物,通过RT-PCR技术克隆获得了一段长度1 141 bp的序列。生物信息学分析表明,该序列编码的381个氨基酸,与其他植物同源GAPDH基因序列的相似度达83%,氨基酸序列相似度在95%以上。可以确定,克隆获得的片段即为箭筈豌豆甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因片段。将此片段命名为VsGAPDH,在GenBank注册,登录号HM117006。

斑玉蕈甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆与序列分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是糖酵解和卡尔文循环中的关键酶,本实验室之前的研究发现斑玉蕈菌丝的GAPDH表达随培养基中葡萄糖添加浓度的变化而变化,在此基础上我们首次克隆了斑玉蕈GAPDH的DNA和cDNA序列,结果斑玉蕈gpd基因长2 724 bp,对比基因组DNA和cDNA序列知其中有7个内含子、8个外显子;其理论分子量为36.15 kD、编码蛋白质含338个氨基酸、等电点(PI)为8.24。

条斑紫菜细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA克隆和序列分析

利用已知甘油醛 3 磷酸脱氢酶 (GAPDH)的特征性保守区域获得的探针筛选条斑紫菜cDNA文库 ,获得了 1个全长的cDNA克隆GAP2 ,编码细胞质甘油醛 3 磷酸脱氢酶 (GAPC)。其中GAP2cDNA插入片段为15 96bp ,包括一个 10 0 8bp的开放阅读框编码 336个氨基酸的细胞质甘油醛 3 磷酸脱氢酶 (GAPC)蛋白。将获得的GAPC蛋白的氨基酸序列与其它物种的GAPDH序列进行多重序列比较后 ,发现条斑紫菜的GAPC氨基酸序列包含了 4个高度保守的结构域。条斑紫菜GAPC的cDNA序列中GC含量很高 ,为 6 4 .2 % ,与紫菜EST分析中得到的结果 ( 6 5 .2 % )近似。通过GAPDH的分子发育进化分析 ,对红藻的分类地位进行了初步探讨。条斑紫菜的细胞质甘油醛 3 磷酸脱氢酶的cDNA序列已登记到GenBank数据库 ,序列号分别为 :AY2 7382 0。

毛竹甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与序列分析

为了分离毛竹抗逆相关基因,利用RT-PCR和RACE技术,从毛竹叶片中克隆出甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因PeGAPDH的全长cDNA序列(GenBank登录号GU356597)。该序列全长1368bp,完整阅读框1013bp,编码一个具有337个氨基酸残基的蛋白。利用生物信息学软件对PeGAPDH蛋白进行了分析,结果表明:PeGAPDH蛋白分子量为36.643kDa,等电点为6.33;该蛋白含有2个保守区,即N端的NAD+结合区和靠近C端的催化功能区。PeGAPDH是一种亲水性、非分泌型蛋白,定位于膜的表面,属于氧化还原酶系,主要在中间产物代谢和能量代谢中起作用。蛋白质进化树的构建结果表明:PeGAPDH与水稻等禾本科植物来自细胞质中的GAPDH蛋白的亲缘关系很近,同双子叶植物的GAPDH则相差较远。

粘虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫(Mythimna separata(Walker))cDNA为模板,对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因进行克隆获得全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对GAPDH全长cDNA序列及推测得到的GAPDH蛋白序列进行分析.结果表明,获得的粘虫GAPDH基因cDNA序列长度为1 317 bp,其中包括80 bp的5′非编码区、238 bp的3′非编码区和999 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码一个332个氨基酸蛋白,具有GAPDH蛋白家族的两个功能结构域.该GAPDH蛋白理论相对分子质量为35.498 6 kDa,等电点为7.63,富含6种类型的特定功能位点.该蛋白序列与其他动物GAPDH蛋白序列具有77.4%～92.9%高度同源性.GAPDH基因表达量检测结果显示GAPDH在粘虫6种不同组织间表达量无显著差异(P>0.05),表明GAPDH可作为研究粘虫功能基因表达量分析的可靠内参基因.该基因的cDNA序列已经递交GenBank并获得登录号为HM055756.

杜氏盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子驱动氯霉素乙酰转移酶基因的表达及其活性检测

目的为建立稳定高效的盐藻生物反应器寻找合适的内源性启动子驱动表达外源基因。方法克隆鉴定了盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因5'上游区序列并成功构建由盐藻GAPDH基因启动子驱动的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因表达载体pUC-Gcat。利用构建的表达载体电击转化盐藻并在含有氯霉素的培养基中筛选转化藻株。随机挑选稳定转化的盐藻藻株进行CAT酶联免疫吸附测定分析。结果获得3株稳定转化的盐藻藻株。聚合酶链式反应鉴定和CAT酶联免疫吸附测定分析结果表明,CAT基因已整合到了转化的盐藻基因组中。结论本研究所克隆的内源性盐藻GAPDH基因启动子能够驱动CAT基因在盐藻中表达。

白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氢酶抗体的检测

目的:探讨白色念珠菌感染的患者中血清3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体的检测及临床意义。方法:将先前制备的GAPDH蛋白进行纯化并测定蛋白浓度,应用纯化后的蛋白包被96孔板。将临床初步诊断为白念感染,并经实验室唾液培养法检测出白色念珠菌的患者31例,正常人对照10例。采取血清样本,用ELISA法检测GAPDH抗体。结果:病人组的OD值为1.27832±0.227217,对照组的OD值为0.98143±0.094286,病人组明显高于对照组(P<0.05)。结论:GAPDH蛋白在体内是高表达,是患者体内的一种保护性抗体。

枣甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆及表达分析

以‘金丝小枣’为试材,根据GAPDH基因保守序列设计引物,采用同源克隆和RT-PCR法,克隆枣GAPDH基因并进行生物信息学及转录表达分析。结果表明:该基因包含完整的开放阅读框为1 020bp,编码339个氨基酸残基,预测分子量为36.904kDa,理论等电点为8.53,命名为ZjGAPDH(KP147910);该蛋白包含2个保守结构域,即Gp_dh_N superfamily和Gp_dh_C superfamily;系统进化树分析表明,ZjGAPDH与其它物种GAPDH蛋白的同源性相对较小,但均属于存在细胞质中参与糖酵解过程的蛋白;实时荧光定量分析表明,ZjGAPDH基因在枣果实不同发育时期中表达有显著差异,在幼果期和全红期果实中的表达丰度较高。