拟南芥和油菜3-磷酸甘油酰基转移酶的关键活性位点鉴定

【目的】3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)催化三酰甘油(TAG)生物合成途径中的第1步酰化反应,TAG合成能力是油料作物的关键性状,但亦与人类肥胖症密切相关,了解GPAT结构与功能的内在关系对于这一性状的遗传或化学遗传调控至关重要。本研究旨在鉴定调控植物GPAT活性的关键氨基酸位点。【方法】运用定点突变技术构建了58个GPAT9突变基因,结合GPAT特异的酵母遗传互补法,剖析单一和多个氨基酸位点改变对GPAT9酶活性的影响。【结果】通过对拟南芥Arabidopsis thaliana AtGPAT9和油菜Brassica napus BnGPAT9的19个氨基酸残基进行分析发现:AtGPAT9的N端6个磷酸化位点的单独突变(T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和S31A)不能增强AtGPAT9在酵母异源表达时的活性。相反,其他6个位于酰基转移酶保守结构域外的氨基酸残基(85、114、119、230、237、322位)的改变能够显著影响GPAT9酶活性。发现这些氨基酸残基之间存在交互作用,例如,3个位点同时突变(Y85W/N119H/S237N)能使AtGPAT9活性大幅上升,加速酵母的生长并促进TAG的合成,表达这一突变酶的酵母中的TAG含量比表达野生型BnGPAT9的增加了45.7%。更值得注意的是,在114和237位磷酸化氨基酸残基对酰基转移酶活性产生负面效应,暗示植物GPAT9活性可能受磷酸化和非磷酸化机制调节。【结论】本研究获得了6个未经报道的关键GPAT酶活性调控位点,其中W85和H119是GPAT9正常功能所必需的,而L114、D230、N237和A322有利于维持GPAT9活性。

玉米甘油-3-磷酸酰基转移酶基因ZmGPAT13生物信息学及表达特性分析

【目的】对玉米(Zea mays L.)甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)家族成员ZmGPAT13进行生物信息学分析和在不同非生物胁迫处理下的基因表达模式变化检测,为进一步研究ZmGPAT13的生物学功能奠定理论基础。【方法】通过TAIR和MaizeGDB数据库获得拟南芥(Arabidopsis thaliana)和玉米中GPAT家族蛋白序列,利用生物信息学方法进行理化性质、蛋白结构、亚细胞定位、保守基序、系统进化、磷酸化位点和启动子顺式作用元件等分析,并采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对ZmGPAT13在不同组织部位及甘露醇(Mannitol)、NaCl、脱落酸(ABA)、高温(42℃)、低温(4℃)处理下的相对基因表达量进行分析。【结果】ZmGPAT13是一个定位于线粒体的跨膜蛋白,与部分GPAT家族成员含有排序相同的15个保守基序(motif),且与拟南芥中AtGPAT1的亲缘关系最近;预测分析发现ZmGPAT13含有62个磷酸化位点,可能与玉米中多个GPATs存在相互作用关系;ZmGPAT13基因启动子富含多种与低温和ABA响应等相关的顺式作用元件。通过qRT-PCR技术对ZmGPAT13组织表达模式分析发现ZmGPAT13的相对基因表达量在胚芽鞘(Coleoptile)中最高,根(Root)中次之,叶片(Leaf)中最低;甘露醇(Mannitol)、NaCl、脱落酸(ABA)及高温(42℃)和低温(4℃)处理均能诱导ZmGPAT13的基因表达显著上调。【结论】玉米中ZmGPAT13具有高度的进化保守性,可能通过转录水平的变化参与调控玉米对干旱、盐、高温和低温等非生物胁迫的响应过程。

刺五加甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的鉴定与分析

刺五加(Eleutherococcussenticosus)为我国名贵中药,甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)参与光合作用和能量代谢,可能对药用活性成分合成有着重要影响。为了深入理解刺五加的生物学机制,本研究使用ExPASy、TBtools、MEGA11和EasyCodeML等工具对刺五加的GAPDH基因家族进行鉴定和分析。共得到26条GAPDH基因,其编码蛋白普遍呈中性且具有较好的脂溶性,主要分布于细胞质和叶绿体。蛋白结构中,α螺旋占多数,推测其起主要作用。系统发育分析发现26条GAPDH基因可分为三大分支,基因结构中包含较多外显子,推测拥有更加丰富的多肽加工机制以实现不同的生物学功能。基因在染色体上均匀分布,共线性分析得到17个染色体间共线性基因对。压力选择分析显示相关基因受到负选择压力,保守基序高度相似,在进化过程中的高度保守。蛋白互作网络发现GAPDH与多个蛋白关系密切。这些结果揭示了GAPDH在刺五加光合作用、能量代谢和次生代谢等方面的重要性和功能多样性,为深入理解刺五加的生物学机制提供了有力支持。

高温胁迫下转甜椒正义甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT)烟草缓解PSⅡ光抑制

【目的】探讨类囊体膜脂组成与高温光抑制的关系。【方法】以转甜椒正义甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT)的烟草植株为试验材料,测定了类囊体膜脂组成,高温胁迫后的光合参数和叶绿素荧光参数。【结果】转基因烟草植株类囊体膜的单半乳糖甘油二脂(MGDG),双半乳糖甘油二脂(DGDG),硫代异鼠李糖甘油二脂(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)的饱和程度均上升,其中MGDG饱和程度增加了16.2%,上升幅度最为显著。随胁迫温度的升高,转基因烟草植株与野生型植株Fv/Fm,ΦPSⅡ和Pn逐渐下降,但转基因植株下降幅度小于野生型,48℃时差异最为显著。【结论】转基因烟草植株类囊体膜脂脂肪酸饱和度增加,提高了PSⅡ热稳定性,缓解了PSⅡ光抑制。

冷诱导下毛百合甘油-3-磷酸酰基转移酶活性变化及其基因保守区的克隆

探讨了野生毛百合甘油-3-磷酸酰基转移酶活性在冷胁迫下的变化,用简并引物扩增了甘油-3-磷酸酰基转移酶基因保守区序列的结果表明,该保守区段长744 bp,推测编码247个氨基酸。在GPAT氨基酸序列中存在1个高度保守的区域(WIAPSGGRDRP),在NCBI上经过BLASTp比对分析,发现这段保守区序列为LPLAT基因超级家族酶类的催化活性区,此家族多为催化酰基辅酶A(acylCoAs)或者酰基载体蛋白(acylACPs)中的酰基与受体蛋白结合的酰基转移酶类。此序列Genbank登录号为HQ654523。

甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPATs)的研究进展

甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferases,GPATs)催化甘油三酯和甘油磷脂合成的第一步反应。目前在哺乳动物已发现四种亚型GPAT1-4,其中GPAT1和GPAT2定位于线粒体外膜,而GPAT3和GPAT4定位于内质网。GPATs在调节细胞甘油三酯和磷脂含量中起着重要的作用。基因过表达和敲除实验证实GPATs在肝脏脂肪变性、胰岛素抵抗和肥胖的发生发展过程中起着重要作用,并且部分亚型影响泌乳、精子发生等过程。本文将就GPATs各亚型的功能特点进行综述。

花生甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆与序列分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的功能及作用机理在模式植物拟南芥中已经得到了较为充分的研究,但是在花生中还没有关于这类基因的报道,其功能也没有得到证实。本研究通过Bioedit软件在花生cDNA文库中找到了6个可能编码GPAT蛋白的基因片段,其中有3个基因没有包含完整的开放阅读框。我们通过5'-和3'-RACE RT-PCR对这3个基因的全长进行了克隆,得到了包含完整读码框的基因序列,并将序列在GenBank上注册,同时对得到的序列进行了初步分析。

黑子南瓜甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

依据国外报道的南瓜甘油－３－磷酸转酰酶（ＧＰＡＴ）基因的ｃＤＮＡ序列合成相应引物，用ＲＴ－ＰＣＲ技术，成功地分离了黑子南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｆｉｃｉｆｏｌｉａ）ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ片段，并亚克隆到了ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统的多克隆位点上，序列分析表明黑子南瓜ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ序列及递推的氨基酸序列与南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｍｏｓｃｈａｔａ）相比分别具有９８％和９６５％的同源性。在１１８８ｂｐ中有２２个核苷酸发生变化。

兵豆甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆和序列分析及蛋白质二级结构的预测

克隆了云南强抗冷性植物兵豆 (Lensculinaris)GPAT基因的编码区完整的cDNA片段 ,该片段长 1374bp ,编码 4 5 7个氨基酸残基。与豌豆 (Pisumsativum)、蚕豆 (Viciafaba)和长柔毛野豌豆 (Viciavillosa)相比较 (从剪切点起 ) ,氨基酸序列的同源性分别为 96 2 1%、95 6 6 %和 95 6 6 %。应用PSIPREDHFORMAT预测了这 4种植物GPAT酶的二级结构。

羽衣甘蓝甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

以羽衣甘蓝品种白孔雀为试验材料,通过同源克隆和RACE方法从低温诱导的羽衣甘蓝幼苗中分离得到了羽衣甘蓝甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)基因的全基因序列,采用生物学软件对该序列进行生物信息学分析。结果表明:该基因全长1558bp,推测其编码451个氨基酸,并命名为BaGPAT。序列分析发现,羽衣甘蓝BaGPAT基因推导的氨基酸与已知其他植物GPAT基因序列有54%～85%的相似性。聚类分析结果显示:羽衣甘蓝GPAT(BaGPAT)基因与拟南芥和宽叶独行菜GPAT基因亲缘关系较近。

花生甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因的克隆及表达分析

本研究从花生中克隆得到2个GPAT基因,分别命名为AhGPAT3和AhGPAT5。AhGPAT3基因全长为1653bp,编码550个氨基酸;AhGPAT5基因全长为1383bp,编码460个氨基酸,均属于GPATs蛋白质家族。通过实时定量PCR检测克隆到的GPAT基因在花生不同组织、种子不同发育时期、多种非生物逆境胁迫及多种激素处理下的表达模式。结果显示,AhGPAT3与高等植物的GPAT3和GPAT2亲缘关系最近;AhGPAT5与高等植物的GPAT5和GPAT7亲缘关系最近。AhGPAT3和AhGPAT5基因在种子发育初期和下胚轴中的表达量较高;另外,发现AhGPAT3基因很可能参与了花生对低温、高盐和干旱的抗性调节。

麻疯树质体甘油-3-磷酸酰基转移酶(JcGPAT2)cDNA的克隆及序列分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT:EC2.3.1.15)是催化脂肪酰基转移到甘油-3-磷酸的Sn-1位上合成1-酰基-Sn-甘油-3-磷酸(溶血磷脂酸)的酶。通过设计兼并引物和RACE引物,克隆得到麻疯树质体JcGPAT2基因(GenBank登录号:FJ952147),其cDNA全长1 516 bp,其中编码区1 389 bp,编码462个氨基酸,与蓖麻等植物GPAT基因高度同源,且含有4个保守功能结构域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。表达分析表明,JcGPAT2在麻疯树各组织中为组成型表达,在胚中最高而茎中最低;在种子发育过程中,Ⅰ、Ⅱ期表达量较高,Ⅲ期表达量减弱后在IV期又显著增强;在冷处理麻疯树叶片中,其受冷诱导后表达量在处理4 h时显著增加,12 h后又逐渐降低。表明JcGPAT2在种子油脂合成和抗冷性反应中可能起到重要作用。

长柔毛野豌豆编码甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

甘油 - 3-磷酸酰基转移酶 (GPAT)基因与植物抗冷性密切相关。克隆到的长柔毛野豌豆 (Viciavillosa)GPAT基因的编码区完整的cDNA片段长 1377bp ,编码 4 5 8个氨基酸残基 ,与蚕豆 (Viciafaba)和豌豆 (Pissumsativum)比较 ,其核苷酸序列的同源性分别为 94 1%和93 3% ,氨基酸序列的同源性分别为 96 9%和 98 0 %。

铁观音茶树甘油-3-磷酸酰基转移酶(CsGPAT)基因克隆及萎凋过程中的表达分析

【目的】以铁观音茶树鲜叶为试验材料,对参与甘油磷脂代谢途径的茶树甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase,CsGPAT)进行克隆、生物信息学分析以及不同萎凋温度的表达量分析,了解GPAT基因在茶叶萎凋过程中的重要意义,以期为茶叶萎凋过程中温度调控提供理论基础。【方法】基于乌龙茶加工(萎凋)转录组数据,筛选获得茶树GPAT同源序列。利用ExPASy Protparam、SMART、SignalP 4.1Server、PSORT、prediction protein等在线软件进行生物信息学分析,利用SWISS-MODEL在线工具编辑GPAT蛋白质三维结构;在NCBI Blastp进行氨基酸序列同源比对。提取铁观音叶片RNA进行qRT-PCR,检测实时表达情况,克隆茶树GPAT基因全长。【结果】克隆得出CsGPAT(IDcsa:CSA000941.1/IDcss:TEA019813.1)基因序列全长1554 bp,编码497个氨基酸;GPAT蛋白属于稳定疏水性蛋白,不含信号肽,具有磷脂生物合成功能的PlsC域;进化树分析表明CsGPAT基因与油茶的亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果显示CsGPAT基因在20℃温度萎凋时表达量最高。【结论】CsGPAT基因在茶叶萎凋受到相对低温胁迫时,表达量上调,表明CsGPAT表达与茶叶萎凋过程中的温度调控密切相关。

花生3-磷酸甘油酰基转移酶基因的功能鉴定

花生(Arachis hypogaea)是我国的主要油料作物,花生油脂的合成受3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)调控,但其调控机制尚不清楚。从花生中克隆了13个GPAT基因,编码含有4个酰基转移酶保守结构域的蛋白;同时,运用酵母遗传互补体系对基因功能进行了鉴定。在该体系中,酵母双突变体菌株ZAFU1(Δgat1/Δgat2)因缺少GPAT而不能在特定的葡萄糖培养基上生长。结果表明,AhGPAT1/2/3/6/9与空白载体一样,其导入并不能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长缺陷,而AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的导入能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长缺陷,说明上述3个基因具有酰基转移酶活性,从而为进一步研究花生油脂的合成代谢调控提供了参考。

微小隐孢子虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶的定位及活性检测

本研究以微小隐孢子虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Cryptosporidium parvum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,CpGAPDH)为对象,研究其亚细胞定位和酶动力学特征。设计特异性抗原多肽并免疫家兔,获得多克隆抗体,利用亲和纯化法获特异性抗体;经Western blot方法验证该抗体特异性,再通过间接免疫荧光法(IFA)进行蛋白定位。通过原核表达获得GST重组蛋白(GST-CpGAPDH),基于GAPDH的酶促反应利用辅酶NAD(H)或NADP(H)为电子受体或供体的原理,通过吸光度比色法监测反应中NAD(H)/NADP(H)的增加或减少鉴定其酶活性。结果显示,成功获得并纯化抗CpGAPDH抗体;Western blot分析显示该抗体可识别条带大小为40 kDa;IFA结果表明该蛋白主要分布于子孢子胞浆内,部分呈现颗粒状。利用重组蛋白确定了CpGAPDH的酶活性;在两种辅酶中,CpGAPDH更倾向于使用NAD(H)进行酶活反应。结果表明,本研究确定了CpGAPDH在虫体细胞的定位及酶活性检测,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

毛竹甘油3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因家族成员的生物信息学分析

以已知拟南芥、水稻的GPAT基因信息为基础,利用毛竹(Phyllostachys pubescens)基因组数据库分析了GPAT基因在毛竹中编码的相关酶类,确定了毛竹基因组中含有16个毛竹GPAT基因,并分析了这些基因的核苷酸序列长度、编码氨基酸的数量、蛋白分子量、基因结构和氨基酸序列保守结构域。

杜氏盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子驱动氯霉素乙酰转移酶基因的表达及其活性检测

目的为建立稳定高效的盐藻生物反应器寻找合适的内源性启动子驱动表达外源基因。方法克隆鉴定了盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因5'上游区序列并成功构建由盐藻GAPDH基因启动子驱动的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因表达载体pUC-Gcat。利用构建的表达载体电击转化盐藻并在含有氯霉素的培养基中筛选转化藻株。随机挑选稳定转化的盐藻藻株进行CAT酶联免疫吸附测定分析。结果获得3株稳定转化的盐藻藻株。聚合酶链式反应鉴定和CAT酶联免疫吸附测定分析结果表明,CAT基因已整合到了转化的盐藻基因组中。结论本研究所克隆的内源性盐藻GAPDH基因启动子能够驱动CAT基因在盐藻中表达。

氨甲酰化诱导的牛晶状体3-磷酸甘油醛脱氢酶和硫醇转移酶的失活(英文)

目的:3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解过程中的一个关键酶,与老化和白内障发生密切相关,硫醇转移酶(TTase)可断裂晶状体蛋白质氧化形成的二硫键使硫醇化的蛋白质脱硫醇,对于维持晶状体透明性极为重要。氨甲酰化为重要的翻译后修饰。本研究观察氨甲酰化是否能诱导晶状体GAPDH和TTase的失活。方法:透明新鲜的晶状体取自2周岁健康牛,与100mmol/L氰酸钾于37℃水孵箱分别振动温育7d和12d。设透明晶状体为正常对照组。所有晶状体孵育在50mmol/LDMEM液中,然后每只晶状体去囊膜,匀浆,提取水溶性蛋白质。用分光光度计分别测量GAPDH和TTase的活性。结果:与氰酸钾孵育后GAPDH的活性与正常对照组相比显著降低(P<0.01),其中12d组与7d组相比,活性明显下降。TTase的活性在孵育7d后与对照组相比有统计学差异(P<0.05),12d组的活性与对照组相比有显著差异(P<0.01),7d组活性与12d组相比无统计学差异(P=0.19296)。结论:研究结果显示,分别与100mmol/L氰酸钾孵育7d和12d后,氨甲酰化组的GAPDH和TTase活性与对照组相比有统计学差异,证实氨甲酰化可以诱导GAPDH和TTase酶的失活,为TTase和GAPDH在白内障发病机制中的进一步研究提供了新思路。

酰基甘油激酶通过影响PTEN/PI3K/Akt/Gsk3β信号通路调控血小板活化

目的:探究酰基甘油激酶(AGK)在血小板活化中的作用及可能的调控机制。方法:分别提取野生型小鼠(WT)和AgkG126E点突变(AGK激酶活性丧失)小鼠(PM)的血小板。将等体积、等浓度的WT或PM小鼠的血小板放入聚集仪,分别利用3种刺激剂(α-Thrombin、ADP、U46619)刺激,检测每种刺激剂作用下相应的血小板聚集水平;每管聚集曲线达到最大稳定值后,加入等体积的ATP荧光检测剂,检测相应血小板活化过程中释放的ATP水平。分别在静息态WT或PM小鼠血小板(不加α-Thrombin刺激)、活化态WT或PM小鼠血小板(加入α-Thrombin刺激)中加入等量荧光偶联的纤维蛋白原(Fg),利用流式细胞仪检测血小板的Fg结合水平。Western blot法分别检测静息态(不加刺激剂)和活化态(加入α-Thrombin、ADP、U46619刺激)WT或PM小鼠血小板中关键信号通路蛋白的磷酸化水平。结果:在刺激剂作用于血小板后,PM小鼠血小板的聚集程度、ATP释放水平及Fg结合能力均明显低于WT小鼠的血小板(P均<0.01)。与WT小鼠相比,PM小鼠的血小板在活化过程中张力蛋白同源性磷酸酶(PTEN)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt-Thr308)和糖原合成激酶3β(Gsk3β-Ser9)的磷酸化水平均明显降低(P均<0.01)。结论:酰基甘油激酶可能通过影响PTEN/PI3K/Akt/Gsk3β信号通路,参与调控血小板的活化。