甘草水提物促进Erastin诱导CRC细胞株发生铁死亡

目的:研究甘草水提物能否促进Erastin诱导结直肠癌(CRC)细胞株发生铁死亡。方法:2种CRC细胞(Caco-2、SW837)分别分为5组:空白对照组、甘草水提物低浓度(50μg/mL)组、甘草水提物高浓度(100μg/mL)组、甘草水提物高浓度(100μg/mL)+铁死亡诱导剂Erastin(30μmol/L)组、甘草水提物高浓度(100μg/mL)+铁死亡诱导剂Erastin(30μmol/L)+Fer-1(30 nmol/L)组。MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡、死亡情况及细胞ROS生成量、线粒体膜电位变化,CCK-8实验验证细胞死亡方式,并检测Fe^(2+)、MDA、GSH水平和SLC7A11、DPP4、NOX1、GPX4蛋白表达。结果:与空白对照组比较,程序性坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、自噬抑制剂3-MA均不能阻断甘草水提物联合Erastin处理导致的细胞死亡,而铁死亡抑制剂Fer-1能抑制甘草水提物联合Erastin处理导致的细胞死亡,说明细胞死亡为铁死亡。甘草水提物100μg/mL组和甘草水提物100μg/mL+Erastin组Caco-2、SW837细胞中ROS生成量、MDA含量、Fe^(2+)含量及DPP4蛋白表达显著升高,线粒体膜电位、GSH水平及SLC7A11、NOX1、GPX4蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。与甘草水提物100μg/mL+Erastin组比较,Fer-1的加入使得Caco-2、SW837细胞中ROS生成量、MDA含量、Fe^(2+)含量及DPP4蛋白表达显著降低,线粒体膜电位、GSH水平及SLC7A11、NOX1、GPX4蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:甘草水提物能诱导CRC细胞株发生铁死亡。

甘草水提物联合Erastin对结直肠癌细胞在裸鼠体内铁死亡的影响

目的:探究甘草水提物(Licorice extract,LE)联合Erastin对结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)细胞在裸鼠体内铁死亡的影响。方法:18只雌性BALB/c裸鼠皮下接种CACO2细胞建立CRC异种移植动物模型,随机分成模型组、LE组、LE+Erastin组,每组6只,给药4周。给药结束后,记录肿瘤体积和重量,HE染色观察肿瘤组织的病理变化,检测肿瘤细胞MDA和GSH含量,免疫组化检测肿瘤组织Ki-67和SLC7A11 mRNA表达,Western blot检测瘤组织SLC7A11、DPP4和NOX1蛋白的表达。结果:与模型组相比,LE组、LE+Erastin组小鼠肿瘤体积、质量显著降低(P<0.01);与LE组相比,LE+Erastin组小鼠肿瘤体积显著降低(P<0.01)。HE染色结果可见模型组小鼠肿瘤组织无明显改变;LE组小鼠肿瘤组织结构破坏,内有大量的淋巴细胞和白细胞浸润,出现大量坏死细胞;LE+Erastin组异型细胞减少,病理损伤程度更严重。与模型组相比,LE组、LE+Erastin组肿瘤组织MDA及DPP4蛋白含量显著升高(P<0.01),GSH含量降低,肿瘤组织SLC7A11、Ki-67表达及SLC7A11、NOX1蛋白水平显著降低(P<0.01);与LE组相比,LE+Erastin组肿瘤组织MDA含量水平显著升高,GSH含量降低,SLC7A11表达及SLC7A11、NOX1蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:LE联合Erastin能够促进CRC细胞在裸鼠体内发生铁死亡,进而抑制CRC细胞的生长。

发酵黄芪—甘草水提物对817肉鸡生长性能、免疫器官指数和肉品质的影响

试验旨在研究发酵黄芪—甘草水提物对817肉鸡生长性能、免疫器官指数和肉品质的影响。选用1日龄健康817肉鸡90只,利用单因子完全随机试验设计,将90只肉鸡随机分为空白对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组,每组3个重复,每个重复10只鸡。对照组饲喂基础日粮+清水、试验Ⅰ组饲喂基础日粮+未发酵黄芪—甘草水提物(饮水给药)、试验Ⅱ组饲喂基础日粮+发酵黄芪—甘草水提物(饮水给药),未发酵中药、发酵中药均用水稀释2 000倍。在试验第21和42天,分别测定肉鸡的平均日增重、料肉比、免疫器官指数及肌肉(胸肌、腿肌)营养成分含量、肉色、滴水损失等肉品质指标。结果显示:1~42日龄时,与对照组相比,Ⅰ、Ⅱ组平均日增重分别提高5.09%(P<0.05)和12.72%(P<0.05),料肉比分别降低10.84%(P<0.05)和22.09%(P<0.05)。21日龄时,与对照组相比,Ⅰ、Ⅱ组脾脏指数分别提高4.40%(P>0.05)和13.19%(P>0.05),法氏囊指数分别提高32.39%(P<0.05)和37.09%(P<0.05);42日龄时,与对照组相比,Ⅰ、Ⅱ组脾脏指数分别提高31.97%(P<0.05)和50.82%(P<0.05),法氏囊指数分别提高16.25%(P>0.05)和38.13%(P<0.05)。21、42日龄,Ⅰ、Ⅱ组肝脏指数均高于对照组。42日龄时,与对照组相比,Ⅰ、Ⅱ组胸肌肌肉水分含量(P<0.05)、粗脂肪含量(P<0.05)、肉色a*值和肌苷酸含量均提高,肉色b*值和滴水损失均降低;Ⅰ、Ⅱ组腿肌肌肉水分含量、粗蛋白质含量、肉色a*值和肌苷酸含量(P<0.05)均高于对照组,肉色b*值和滴水损失(P<0.05)均降低;对照组、Ⅰ组和Ⅱ组胸肌和腿肌肉色L*值均差异不显著(P>0.05)。综上所述,发酵黄芪—甘草水提物可在一定程度上提高817肉鸡的生长性能和免疫功能,改善肉品质,且作用效果优于未发酵中药。

甘草水提物对雷公藤甲素致大鼠急性肝损伤的改善作用及对其体内IL-10、TNF-α水平的影响

目的:观察甘草水提物对雷公藤甲素致大鼠急性肝损伤的改善作用及对其体内IL-10、TNF-α水平的影响。方法:60只健康雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组(异甘草酸镁)和甘草水提物低、中、高剂量组。空白对照组、模型组大鼠灌胃等容生理盐水,阳性对照组大鼠灌胃异甘草酸镁药液(13.5 mg/kg),甘草水提物低、中、高剂量组大鼠灌胃甘草水提物药液(120、240、480 mg/kg,以提取物量计),给药体积均为1 mL,每天1次,连续给药7 d。第8天时,模型组、阳性对照组和甘草水提物各剂量组大鼠均一次性灌胃雷公藤甲素药液(0.6 mg/kg)以建立急性肝损伤模型。采用苏木精-伊红染色法检查大鼠肝组织病理学变化;采用酶偶联反应法检测各组大鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的活性;采用Western blotting法检测大鼠肝组织中白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的蛋白表达水平。结果:与空白对照组比较,模型组大鼠肝组织出现明显病理学变化,血清中ALT、AST活性均显著升高,肝组织中TNF-α蛋白表达水平显著升高、IL-10蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,甘草水提物各剂量组大鼠肝组织病理学变化程度明显减轻;除甘草水提物低剂量组大鼠血清中AST活性外,甘草水提物各剂量组大鼠血清中ALT、AST活性和肝组织中TNF-α蛋白表达水平均显著降低,肝组织中IL-10蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:甘草水提物能减轻雷公藤甲素所致大鼠急性肝损伤,其机制可能与下调促炎因子TNF-α的表达、上调抗炎因子IL-10的表达有关。

基于RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的甘草水提物生物限值测定研究

目的建立基于小鼠巨噬细胞系RAW264.7吞噬功能的甘草水提物生物限值测定方法,从生物活性层面对甘草进行质量控制。方法由中国中药有限公司提供4个批次的甘草水提物冻干粉,批号分别为:GCGSQ、GCGSC、GCNMG、GCXJ,GCGSC作为验证使用。首先对细胞实验条件进行优化,并从甘草水提物对巨噬细胞吞噬功能影响的量效关系、精密度、重复性等方面进行考察。采用CCK-8法考察细胞密度、LPS浓度、3个批次甘草水提物对巨噬细胞增殖活性的影响,确定合适的给药浓度范围;采用中性红吞噬实验考察3个批次药物对巨噬细胞吞噬功能的影响,确定药物作用限值及检测限。结果实验结果提示巨噬细胞优选接种密度为3×10~5个/m L、药物作用时间为24 h、LPS浓度为0.25μg/mL,当甘草水提物质量浓度为125~500μg/mL时对巨噬细胞增殖及吞噬功能的影响呈剂量依赖性,当浓度为125μg/mL时促增殖作用和促吞噬功能最强;通过对3个批次甘草水提物对巨噬细胞吞噬功能作用的精密度及重复性进行考察,确定当甘草水提物浓度为125μg/mL为限值剂量,其吞噬指数范围为115%~129%。结论本实验结合甘草免疫调节的药理活性,建立了基于RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的甘草水提物生物限值评价方法,在本研究确定的试验条件下,确定125μg/mL为限值剂量,在该限值浓度下巨噬细胞的吞噬指数在115%~129%范围内,可判断为质量合格。

甘草水提物联合Erastin对二肽基肽酶4诱导结直肠癌细胞铁死亡的作用

目的:探究甘草水提物(licorice extracts, LE)联合铁死亡诱导剂Erastin能否通过二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4,DPP4)诱导人结直肠腺癌上皮细胞(DLD-1)发生铁死亡。方法:将DLD-1细胞随机分为Control组、L-LE组(50μg·mL^(-1)LE)、H-LE组(100μg·mL^(-1)LE)、H-LE+Erastin组(100μg·mL^(-1)LE+30 nmol·L^(-1)Erastin)、H-LE+Erastin+Sita(DDP4抑制剂)组(100μg·mL^(-1)LE+30 nmol·L^(-1)Erastin+31.25μg·mL^(-1)Sita),药物干预24 h。行细胞克隆实验和EDU-594细胞增殖实验测定细胞克隆及增殖情况,ELISA检测细胞Fe2+含量及DPP4活性变化,流式细胞术检测细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量,Western blotting检测细胞中溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、花生四烯酸脂加氢酶3(arachidonate lipoxygenase 3,ALOXE3)蛋白的表达情况。结果:相较于Control组,L-LE,H-LE及H-LE+Erastin处理组细胞的克隆数下降,ROS含量增加(P<0.05或P<0.01);H-LE和H-LE+Erastin处理组细胞的增殖能力降低,Fe^(2+)含量、DPP4活性以及ALOXE3蛋白表达升高,SLC7A11蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。与H-LE+Erastin组相比,加入Sita处理后,细胞的克隆数量、增殖能力及SLC7A11蛋白表达显著增加,而Fe^(2+)含量、DPP4活性、ROS生成量及ALOXE3蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论:LE联合Erastin可通过DPP4诱导结直肠癌(CRC)细胞发生铁死亡。

甘草水提物中miRNA对人免疫细胞基因表达的影响

微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类在转录后水平调节基因表达的非编码小分子RNA,其调控基因表达、影响细胞活性的功能已为人们所重视。近年来miRNA的跨界调控成为新的研究方向,为人们更全面地认识和了解miRNA的功能提供了新的视角。植物miRNA由于通常经过了甲基化修饰,因此较为稳定,不易降解。前期研究表明,甘草干燥药材的水煎剂中存在着丰富的小分子RNA,这为了解甘草的作用机制提供了新的思路。在本研究中,利用从甘草水煎剂中提取的小分子RNA以及合成的miRNA模拟物(mimic)作用于分离自健康人的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),然后利用RT-PCR对其模式识别受体(PRR)基因以及部分转录因子、信号分子和细胞因子的基因表达变化进行了分析。结果表明甘草miRNA对人免疫细胞的基因表达具有明显的调节作用,能够显著抑制T细胞分化相关基因的表达,以及炎症和凋亡相关基因的表达。这为进一步更全面地了解甘草的作用机制以及中药新药的研制带来了新的思路。

甘草水提物对大鼠C-BSA肾炎模型治疗作用的研究

目的研究甘草水提物对阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)诱导的系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)的治疗作用。方法制备C-BSA并进行大鼠尾静脉注射诱导肾炎模型,造模成功后给予大鼠口服甘草水提物4周,观察不同剂量甘草水提物对C-BSA诱导的大鼠MsPGN的改善作用。造模和给药期间监测受试大鼠的体重和24 h尿蛋白,给药结束后检测受试大鼠血清尿素氮和肌酐以及IL-2、IL-6、TNF-α和NF-κB水平的变化。结果与模型组相比,甘草水提物高剂量组和阳性组尿蛋白,血清尿素氮、肌酐和IL-2、IL-6、TNF-α和NF-κB的含量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论甘草水提物可以明显改善C-BSA诱导的大鼠MsPGN,其机制可能与抑制NF-κB活性有关。

甘草水提物多成分肝肠吸收代谢差异研究

目的：探讨甘草水提物多成分的肝肠吸收代谢差异。方法利用液质联用技术对甘草水提物的主要成分进行鉴别，并利用在体封闭肠环模型研究大鼠小肠和肝脏吸收代谢的差异。结果甘草水提物中共鉴别出13种主要化学成分。甘草水提物中部分成分可透过肠壁吸收，且在吸收过程中伴随着成分代谢，在血浆样品中共检测到14种新生代谢产物。肝脏可代谢甘草水提物中多种成分，且较肠吸收代谢过程产生更多的代谢产物。结论肝脏是甘草水提物多成分代谢的主要器官，肠道具有一定代谢作用。小肠和肝脏存在明显的吸收代谢差异。

乌拉尔甘草水提物通过Toll样受体4信号通路激活RAW264.7 细胞

目的 探索乌拉尔甘草水提物（Glycyrrhiza uralensis Fisch.water extract,GUWE）激活RAW264.7细胞的作用及其可能的机制.方法 用不同多糖浓度GUWE（10、50、100、500 μg/ml）处理RAW264.7细胞,MTT法检测GUWE对细胞活性的影响.流式细胞术检测RAW264.7细胞吞噬活性和表面分子的表达.ELISA法检测细胞因子的水平.Western blot检测Toll样受体4（TLR4）信号通路关键分子的活化水平.结果 500 μg/ml GUWE显著降低了RAW264.7细胞的活性,而50 μg/ml、100 μg/ml GUWE增加了细胞的活性.GUWE显著增强了RAW264.7细胞抗原吞噬能力和细胞因子、表面共刺激分子的表达,并呈剂量依赖性.进一步研究表明,GUWE通过TLR4受体激活RAW264.7细胞,提高了TLR4下游MAPK家族中p38、JNK、ERK的磷酸化水平以及NF-kB p65的磷酸化水平.结论 GUWE通过TLR4信号通路激活了RAW264.7细胞.

甘草总皂苷及水提物对肝损伤大鼠肠道菌群的影响

目的探讨甘草总皂苷及水提物对肝损伤大鼠肠道菌群的影响。方法采用ip四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤模型,模型大鼠分为4组,分别ig给予甘草总皂苷和甘草水提物,并以联苯双酯作为阳性对照组,模型组ig生理盐水。同时设对照组,ig给予生理盐水。于给药结束后,测定各组大鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平;收集大鼠粪便,通过16 S rRNA测序对各组大鼠肠道菌群的多样性进行分析。结果与对照组比较,模型组大鼠血清中ALT、AST水平显著升高(P<0.05、0.01);与模型组比较,各给药组大鼠血清中ALT、AST水平均显著降低(P<0.05、0.01);与模型组比较,联苯双酯组大鼠菌群结构未发生显著变化,而甘草总皂苷组及甘草水提物组均表现出不同的群落组成。并且相对于水提物组,总皂苷组显著提高了乳酸杆菌属和杆菌门S24-7科菌群的相对丰度。但甘草总皂苷组和甘草水提物组的大鼠肠道菌群与对照组大鼠肠道菌群之间仍存在差异,并没有完全恢复到正常状态。结论甘草总皂苷与甘草水提物均可以改善慢性肝损伤,并对肝损伤大鼠肠道菌群发挥不同的调控作用。