甘蔗分子伴侣ShDnaJ基因克隆及在甘蔗线条花叶病毒胁迫下的表达分析

【目的】克隆甘蔗分子伴侣基因Sh DnaJ,并分析其在甘蔗线条花叶病毒(SCSMV)胁迫下的表达模式,为探究ShDnaJ基因在甘蔗应答SCSMV侵染过程中的功能和作用机制提供理论参考。【方法】通过同源克隆技术克隆ShDnaJ基因完整开放阅读框(ORF)序列,利用生物信息学软件对其进行分析,再利用绿色荧光蛋白(GFP)融合表达法分析ShDnaJ蛋白的亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR检测ShDnaJ基因在甘蔗不同组织及在SCSMV胁迫下的表达水平。【结果】ShDnaJ基因ORF全长1260 bp,编码419个氨基酸残基,蛋白分子量为45682.47 Da,理论等电点(pI)为8.78,属于稳定的亲水蛋白,含有DnaJ结构域,属于DnaJ超家族成员,定位于内质网。ShDnaJ蛋白的二级结构由113个α-螺旋、31个β-转角、78个延伸链和197个无规则卷曲组成。ShDnaJ蛋白与高粱SbDnaJ蛋白的氨基酸序列相似性最高,为96.93%,说明两者亲缘关系最近。ShDnaJ基因在甘蔗根、茎和叶中均有表达,且根和茎中的相对表达量显著高于叶中(P<0.05,下同),但未成熟茎Sh DnaJ基因的相对表达量高于成熟茎;成熟叶ShDnaJ基因的相对表达量高于未成熟叶。随着处理时间的推移,SCSMV胁迫组和对照组(磷酸缓冲液处理)中ShDnaJ基因的相对表达量整体呈下降趋势,但SCSMV接种后不同时间点ShDnaJ基因的相对表达量均显著高于对照组。【结论】ShDnaJ基因具有组织表达特异性,且组织的成熟程度会影响其表达水平。SCSMV胁迫下该基因表达上调,推测该基因参与调控甘蔗植株对SCSMV的抗性。

甘蔗ShPR10基因的克隆及其编码蛋白与甘蔗线条花叶病毒P1蛋白的互作研究

病程相关蛋白10(pathogenesis related protein 10,PR10)在植物抵抗病毒侵染中发挥重要作用。前期以甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)编码的RNA沉默抑制子P1为诱饵,筛选获得一个甘蔗ShPR10蛋白。为探究ShPR10在甘蔗应答SCSMV侵染过程中的功能,利用同源克隆技术克隆甘蔗ShPR10基因并对其编码蛋白进行生物信息学分析,利用绿色荧光蛋白融合表达法分析ShPR10蛋白的亚细胞定位,采用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证ShPR10与SCSMV P1的互作关系,采用农杆菌共浸润瞬时表达系统和Western blot技术分析ShPR10对P1沉默抑制子活性的影响。结果显示,甘蔗ShPR10基因开放阅读框全长570 bp,编码一个不稳定亲水蛋白,蛋白分子量为21.17 kD,等电点为4.77,含有一个P-loop基序,不含跨膜结构域和信号肽。ShPR10二级结构包含51.85%的无规则卷曲、35.98%的α-螺旋、7.41%的延伸链和4.76%的β-转角。ShPR10蛋白与玉米ZmPR10蛋白的氨基酸序列相似性高达91.53%,两者在进化树上聚为一个分支。ShPR10定位在细胞质和细胞核,与SCSMV P1在酵母细胞和烟草细胞中存在互作关系。ShPR10本身不具有沉默抑制子活性,其表达削弱了P1的沉默抑制子活性,但对P1蛋白的含量无明显影响。综上,ShPR10可能通过结合P1来削弱P1的沉默抑制子活性,从而提高甘蔗对SCSMV的抗性。

甘蔗线条花叶病毒研究进展

甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)是引起甘蔗花叶病的主要病原之一,在世界各大蔗区普遍发生,严重威胁甘蔗产业的发展。综述了SCSMV的生物学特性、发生与危害、鉴定与检测、基因组结构与功能、防治策略等方面的研究进展,以期为深入研究SCSMV及其所致病害提供参考。

甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

【目的】建立甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)的RT-LAMP检测方法,为SCSMV的检测提供技术支持。【方法】根据甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异引物,优化RT-LAMP的反应条件,对比分析RT-LAMP的检测灵敏度和特异性;并在RT-LAMP反应产物中加入SYBR GREEN I进行可视化检测,方便快速判定结果。【结果】成功建立了一种用于检测SCSMV的RT-LAMP方法,可在60~63℃下60 min完成对SCSMV的检测,且具有较高的灵敏度,比传统RT-PCR高100倍,最低检测RNA浓度为167.9×10-5 ng。此外,该方法具有较高的特异性,可特异检测SCSMV。【结论】建立了一种灵敏、简便、快速的SCSMV RT-LAMP检测方法并用于田间甘蔗样品的检测。

甘蔗线条花叶病毒HC-Pro基因的分子变异分析

为了解析甘蔗线条花叶病毒Sugarcane streak mosaic virus(SCSMV)不同分离物HC-Pro基因的分子变异规律,本研究利用RT-PCR法扩增获得SCSMV HC-Pro基因的序列,通过生物信息学分析,分别从重组、系统发生、选择压力等方面研究SCSMV HC-Pro基因的分子变异特征。共测定了44条SCSMV HC-Pro基因序列,相似性最低值为70%;HC-Pro基因重组频率较低,仅发现3个重组位点,其中一个系首次报道;与先前报道相比,部分新测定云南蔗区的SCSMV分离物在HC-Pro基因上形成一个新组-第Ⅲ组;HC-Pro基因处于很强的负选择压力作用,未发现正向选择作用位点。本研究结果进一步证明SCSMV HC-Pro基因具有高度的遗传多样性。

甘蔗线条花叶病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白鉴定

甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)是引起甘蔗花叶病的一种主要病原。SCSMV编码的P1蛋白是RNA沉默抑制子,在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御中发挥关键作用,但其作用机制尚未清楚。与寄主蛋白互作是RNA沉默抑制子发挥其抑制作用的主要途径之一,因此鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的一个重要方法。为探究SCSMVP1抑制寄主RNA沉默的机制,本研究首先将SCSMVP1基因连接到质粒pGBKT7上构建诱饵质粒pGBKT7-P1,然后对pGBKT7-P1进行毒性和自激活检测,最后以pGBKT7-P1为诱饵,采用酵母双杂交技术从甘蔗cDNA文库中筛选与P1互作的寄主蛋白。结果显示,成功构建pGBKT7-P1诱饵质粒。将pGBKT7-P1诱饵质粒转入Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板及液体培养基中生长良好,表明pGBKT7-P1诱饵质粒对Y2HGold酵母菌株无毒性。含pGBKT7-P1诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上无菌落生长,表明pGBKT7-P1诱饵质粒无自激活活性。用pGBKT7-P1诱饵质粒对甘蔗cDNA文库进行筛选,经SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板筛选1次及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板筛选3次后,获得42个阳性酵母克隆,提取阳性酵母质粒并导入大肠杆菌中扩大培养,经测序及blastx比对分析,获得13个可能与SCSMV P1互作的寄主甘蔗蛋白,分别是生长素应答蛋白IAA1、IAA15,转录因子NAC、GATA4、OFP4,真核翻译起始因子eIF5A,分子伴侣DnaJ,辅分子伴侣SBA1,重金属相关异戊二烯化植物蛋白HIPP35,mec-8和unc-52蛋白同系物抑制子SMU2,外膜孔蛋白OEP24,及2个未表征蛋白。基于这些蛋白的功能,推测P1可能通过与寄主蛋白互作来调控寄主防御反应相关基因的表达,和/或通过与寄主蛋白互作来影响寄主RNA沉默相关蛋白的合成、加工或转运,从而发挥其RNA沉默抑制子的功能。研究结果为后续深入解析P1抑制RNA沉默的作用机制奠定了重要基础。

甘蔗线条花叶病毒P1蛋白基因原核表达及抗血清制备

甘蔗线条花叶病毒Sugarcane streak mosaic virus(SCSMV)是引起甘蔗花叶病的主要病原之一,在世界各大蔗区普遍发生,严重威胁甘蔗产业的发展。建立快速有效的检测方法对于SCSMV的防控有着重要意义。本研究依据SCSMV P 1基因序列合成一对引物,扩增获得1074 bp的目的基因,将目的基因与原核表达载体pET28a连接,获得pET28a-P1^(SCSMV)。将连接正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta菌株,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳检测显示在分子量约为42 kDa处有目的蛋白带,与预期的SCSMV P1大小一致。融合蛋白主要是以可溶性蛋白的形式存在。利用镍柱亲和纯化重组的SCSMV P1蛋白,并免疫健康新西兰大白兔,制备兔抗血清。Western blot分析显示,在对多个样品进行检测时制备的抗血清能特异性地识别SCSMV的P1蛋白,在受SCSMV侵染的甘蔗植株中能检测到P1蛋白的表达,而在健康植株中检测不到P1蛋白的表达。制备的抗血清稀释至1∶20000时仍能特异地检测到目的蛋白条带,说明通过大肠杆菌表达P1制备的SCSMV抗血清特异性强,效价高。本研究为SCSMV的快速检测提供了有效方法。

对甘蔗线条花叶病毒存在抗性差异的2个甘蔗品种中eIF4E基因序列分析

甘蔗线条花叶病毒(sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)是近年引起甘蔗花叶病的主要病原,选育和利用抗病品种是防控甘蔗花叶病最经济有效的手段。不同品种对甘蔗花叶病具有不同抗性,明确抗性差异的来源对于选育抗病品种具有重要意义。本研究以SCSMV的高抗品种CP94-1100和高感品种ROC22为对象,对两个品种的致病病毒和真核生物翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)序列进行分析。在致病病毒方面,侵染CP94-1100和ROC22的SCSMV分离物cp基因和vpg基因核苷酸序列和蛋白编码情况基本相同,为同一分子变种。在寄主eIF4E方面,从CP94-1100和ROC22中均分离到eIF4E基因,均包含由663 bp构成的ORF,编码1个含220个氨基酸残基的多肽,氨基酸序列同源性仅为98.2%,说明抗性差异可能与eIF4E差异相关。生物信息学分析显示,CP94-1100和ROC22中eIF4E基因编码的蛋白均为稳定亲水性蛋白,属于IF4E家族蛋白,而CP94-1100中eIF4E基因编码的蛋白还包含1个CDC 33或PTZ00040的结构域。遗传分析表明eIF4E基因与禾本科其他作物高度相似,其中CP94-1100的eIF4E基因与割手密亲缘关系最近,说明它们也具有类似的功能。

我国新育成甘蔗品种(系)对甘蔗线条花叶病毒和高粱花叶病毒的抗性评价

甘蔗花叶病是中国蔗区危害最严重的病毒病,利用抗病品种是控制该病害最经济有效的方法。本研究以中国蔗区甘蔗花叶病的2种主要病原甘蔗线条花叶病毒分离物(SCSMV-JP1,Gen Bank登录号JF488064)和高粱花叶病毒分离物(Sr MV-HH,Gen Bank登录号DQ530434)为接种毒源,采用人工切茎接种和RT-PCR检测相结合方法,于2015年、2016年2次对中国近年选育的71个优良甘蔗新品种(系)进行了双抗SCSMV和Sr MV鉴定与评价。结果表明:71个优良甘蔗新品种(系)中,对SCSMV表现高抗到中抗的有24个,占33.8%,感病到高感的有47个,占66.2%;对Sr MV表现高抗到中抗的有27个,占38.03%,感病到高感的有44个,占61.97%。综合分析结果显示,福农30号、福农36号、闽糖01-77、桂糖02-467、柳城05-129、粤甘34号、粤甘40号、粤糖55号、粤糖96-86、粤糖00-318、赣蔗02-70、云蔗03-258、云蔗04-241、云蔗05-51、云蔗06-80等15个优良新品种(系)双抗SCSM V和Sr M V 2种病毒,占21.13%,其中粤甘34号、粤糖55号、云蔗03-258、云蔗05-51、云蔗06-80等5个优良新品种(系)对2种病毒均表现为高抗,占7.04%,。研究结果明确了71个甘蔗优良新品种(系)对甘蔗花叶病2种主要致病病原的抗性,筛选出双抗SCSMV和Sr MV的甘蔗优良新品种(系)15个,为生产用种选择和有效防控甘蔗花叶病提供了科学依据。

云南蔗区甘蔗线条花叶病毒分离物NIa基因形成新簇

【目的】利用NIa基因,阐明甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)的种系发生关系,为预测SCSMV流行变异趋势及科学防控提供理论依据。【方法】从云南蔗区和国家甘蔗种质资源圃采集感病样品,RT-PCR扩增获得SCSMV NIa基因序列后,使用Splits Tree、RDP、Phy ML、Dna SP等软件分析SCSMV中国分离物的系统发生、选择压力及基因流动等特征。【结果】共获得23条SCSMV NIa基因序列。这些序列间未发生重组,云南蔗区的部分序列形成1个新簇,且云南蔗区与国家甘蔗种质资源圃之间的基因交流不显著。此外,选择压力分析表明,NIa基因受很强的负选择压力作用。【结论】与P1、HC-Pro和CP等基因类似,SCSMV在NIa基因上也包含5个簇;SCSMV云南分离物具有较高的遗传多样性和清晰的地理相关性。

快速灵敏的甘蔗线条花叶病毒免疫学检测体系的建立

甘蔗花叶病广泛存在于我国甘蔗种植区,严重影响甘蔗产业的高质量发展。近年来甘蔗线条花叶病毒在蔗区肆虐,尽管针对其的血清学检测技术已经建立,但是快速、准确、高通量的检测方法亟待发掘。本研究制备了S CSMV CP的抗血清,特异性高,与引起甘蔗花叶病的另两种病原(高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒)间没有血清学交叉反应。基于该多克隆抗体,建立了直接抗原包被的ELISA、斑点杂交、Western blot和基于多抗的免疫试纸条检测技术。开发的免疫试纸条检测技术能快速、准确、高通量应用于田间病毒鉴定。本文提供了基于血清学的快速、准确、高通量,且便捷的甘蔗线条花叶病毒检测技术,有助于我国蔗区甘蔗花叶病的监测与防控。

52个甘蔗品种在广西受病毒侵染情况

为明确国家糖料体系甘蔗集成示范及区试品种在广西被病毒侵染情况,2017年从广西北海、南宁、崇左、百色、来宾、柳城、桂林等地集成示范及区试的52个甘蔗品种上采集带有甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病和甘蔗杆状病毒病显著病症或不显病症叶片样品,采用特异引物通过RT-PCR和PCR方法进行5种病毒检测(甘蔗黄叶病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗杆状病毒)。结果表明,SCYLV的平均检出率为25.00%;SCSMV的平均检出率为7.97%;SrMV的平均检出率为7.69%;SCMV的平均检出率最低,为7.42%;SCBV的平均检出率最高,为68.41%,远远高于其他病毒。7个地方的甘蔗受病毒混合侵染现象普遍存在,北海的病毒混合侵染率甚至高于单一病毒侵染率。52个甘蔗品种在广西受5种病毒的总侵染率为79.67%,对甘蔗的生产安全存在着严重的潜在威胁,建议推广种植甘蔗脱毒种苗来缓解甘蔗病毒病害的危害。