基于RNA-Seq的甘蔗响应鞭黑粉菌侵染的早花相关基因挖掘

甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)是引起甘蔗鞭黑穗病(sugarcane smut)的重要病原菌,侵染甘蔗后通常诱导顶端分生组织产生灰黑色“黑鞭”,在部分甘蔗品种(系)中能诱导植株提前开花,但其作用机制仍不明确。为了探究甘蔗响应鞭黑粉菌侵染的开花相关基因及其表达模式,本研究以同期健康和感染鞭黑粉菌的桂糖42甘蔗品种为实验材料进行转录组测序分析,共筛选出了3276个显著差异表达基因,其中1677个基因上调表达(P<0.05),1599个基因下调表达(P<0.05)。GO富集分析发现差异表达基因主要集中在生物合成过程、核糖体、核糖核蛋白复合体、核糖体结构成分等小类中。KEGG富集结果显示差异表达基因主要集中在氨基酸的生物合成、嘌呤代谢、碳代谢、吞噬作用等代谢通路。筛选到30个与开花途径相关的差异表达基因,并对其中的FT1、PIE1、GID1、GA20ox-1、GA20ox-2等基因进行了qRT-PCR验证,qRT-PCR结果与转录组测序结果基本一致,验证了转录组测序结果的可靠性。本研究结果为解析甘蔗鞭黑粉菌诱导甘蔗提前开花表型的分子机理提供了重要的候选基因,对甘蔗的育种也有重要的参考价值。

广西北仑河口红树林底泥放线菌多样性及其抑制甘蔗鞭黑粉菌活性分析

【目的】分析广西北仑河口红树林底泥放线菌多样性及其次级代谢产物抑制甘蔗鞭黑粉菌活性,为挖掘放线菌新物种及其新型农用杀菌剂打下基础。【方法】选取6种分离培养基,采用稀释涂布法对广西北仑河口红树林底泥样品进行分离培养,ISP2培养基纯化菌株,基于16S rRNA序列分析样品中放线菌多样性,并以牛津杯法对分离得到的菌株进行抑制甘蔗鞭黑粉菌活性测定。【结果】经排重合并和16S rRNA序列比对分析,从广西北仑河口红树林底泥中共分离得到36株放线菌,隶属于6目9科12属,链霉菌属(Streptomyces)为优势菌属,共有5株菌株的16S rRNA序列与标准菌株的相似性低于98.00%,可能为潜在新物种。抑菌活性测定结果表明,36株放线菌中有22株菌对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用,占所分离放线菌总数的61.11%。【结论】广西北仑河口红树林底泥中蕴藏着丰富的海洋放线菌资源,具有开发成新型农用生防杀菌剂的潜力。

广西甘蔗鞭黑粉菌遗传多样性分析

【目的】分析广西甘蔗主产区甘蔗鞭黑粉菌遗传多样性水平，为研究病菌毒力变化及甘蔗病害综合治理提供新思路。【方法】从广西各甘蔗主要产区采集甘蔗鞭黑粉菌样品，提取其中70份单倍体菌株基因组DNA，使用优化的随机扩增多态性DNA标记（RAPD）反应体系和经筛选获得的RAPD引物进行PCR扩增，电泳谱带使用NTSYS 2.1进行聚类分析，并构建系统发育进化树。【结果】使用筛选出的10个RAPD引物进行扩增，获得77条条带，每个引物扩增得到的条带数为4-11条，大小为150-3000 bp，包含6个多态性位点，群体多态位点百分率为7.79%。70个甘蔗鞭黑粉菌的相似系数为0.96-1.00，在0.96的遗传系数上菌株可分为两大类，其中类群1聚集了来自横县校椅镇的两个菌株，其余68个菌株分布在类群Ⅱ中。【结论】广西甘蔗鞭黑粉菌遗传分化度较低，片段多态性和菌株地理来源、寄主和交配型无显著相关性。

海绵Pseudoceratina sp.共栖细菌多样性及其抑制甘蔗鞭黑粉菌活性研究

【目的】探讨广西斜阳岛附近海域海绵共附生细菌的多样性,并筛选对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的活性物质,为发现潜在的细菌新物种及开发农用生防菌肥奠定基础。【方法】采用稀释涂布法,通过6种复合营养分离培养基,从海绵Pseudoceratina sp.中分离可培养的共附生细菌。采取细菌形态学观察去除冗余,通过PCR扩增菌株的16SrRNA基因序列,并通过构建系统发育树分析物种多样性。采用牛津杯法进行抑制甘蔗鞭黑粉菌活性筛选实验。【结果】从海绵Pseudoceratina sp.中共分离到可培养细菌54株,经16SrRNA基因序列对比后,获得24株细菌,隶属于13科14属。其中,菌株BGMRC 2118与已发表有效菌株的16SrRNA基因序列的最高相似率为96.46%,可能为潜在新种。抑菌筛选实验结果显示,有8株细菌的发酵粗提物对甘蔗鞭黑粉菌具有很强的抑菌活性。【结论】广西斜阳岛附近海域中海绵共附生细菌具有较高的物种多样性,蕴藏着丰富的新物种资源,富含生物活性菌株。

甘蔗鞭黑粉菌ISSR-PCR反应体系的优化

以甘蔗鞭黑粉菌交配型分离物为试验材料,采用CTAB法提取基因组DNA,并对影响甘蔗鞭黑粉菌ISSR-PCR反应体系中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立起适合甘蔗鞭黑粉菌基因组DNA的ISSR-PCR反应体系。优化的反应体系为:在25μL体系中,rTaq DNA聚合酶1.5 U、Mg2+浓度为2.0 mmol/L、dNTP浓度为0.2 mmol/L、引物浓度为0.2μmol/L、DNA模板10～20 ng、10×PCR buffer 1μL、用重蒸水补足25μL。

海黄瓜共附生细菌多样性及其对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用

【目的】研究海黄瓜(Pseudocnus echinatus)共附生细菌多样性及其发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用,为甘蔗黑穗病的防治及新型生物农药的研发提供新途径。【方法】利用微生物纯培养技术分离纯化海黄瓜的表皮、肠、胃和肠内容物等组织的共附生细菌,并通过16S r DNA序列分析共附生细菌种类多样性及其在海黄瓜不同部位组织的分布特征;采用牛津杯法测定共附生细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用。【结果】从海黄瓜各部位组织共分离得到79株共附生细菌,归属于4门26科35属46种;优势菌属为:芽孢杆菌属(Bacillus,16.5%)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis,8.9%)、小单孢菌属(Micromonospora,6.3%)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter,6.3%)。分别以甘蔗鞭黑粉菌的"+"型担孢子、"-"型担孢子和菌丝为靶标,采用牛津杯法筛选得到19株活性菌,其中以芽孢杆菌属的BGMRC03005对甘蔗鞭黑粉菌菌丝、"+"型担孢子和"-"型担孢子的抑制作用最强,抑菌圈直径分别为25.40、19.90和14.25 mm。【结论】海黄瓜中可培养细菌种类丰富,且富含对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的菌株。筛选获得的芽孢杆菌属细菌BGMRC03005对3种鞭黑粉菌形态均有抑制作用,具有开发成为微生物农药的潜力。

前体调控对Bacillus sp. 108菌株发酵合成抑制甘蔗鞭黑粉菌活性物质产量的影响

【目的】研究前体调控对Bacillus sp. 108菌株发酵合成抑制甘蔗鞭黑粉菌活性物质24元大环内酯产量的影响,为Bacillus sp.108菌株发酵工艺规模化放大及甘蔗黑穗病的防治提供新途径。【方法】利用单因素优化方法,考察乙酸钠、丙酸钠、正丙醇、异亮氨酸和缬氨酸对Bacillus sp. 108菌株发酵合成24元大环内酯的作用,确定有效前体的最佳添加浓度和添加时间;采用平板对峙法测定Bacillus sp. 108菌株发酵产物24元大环内酯对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用。【结果】乙酸钠是Bacillus sp. 108菌株发酵合成24元大环内酯的最佳前体,在发酵第96 h时添加1.0%乙酸钠,24元大环内酯的产量达104.45μg/mL,比未添加前体发酵的对照组提高58.74%。Bacillus sp. 108菌株发酵粗提物对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长具有较强的抑制作用,半数有效浓度(EC_(50))0为157.94μg/mL。【结论】乙酸钠是Bacillus sp.108菌株发酵合成24元大环内酯较适宜的前体物质,24元大环内酯对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长具有明显的抑制作用,具有开发成微生物农药的潜力。

北部湾海绵(Siphonochalina flexa)共附生细菌多样性及抑甘蔗鞭黑粉菌活性研究

分离纯化广西怪石滩海域海绵可培养共附生细菌,分析其多样性并研究共附生细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性,为研发新型生物农药提供参考依据。采用8种培养基分离纯化海绵共附生细菌,运用16S rDNA测序方法进行菌种鉴定及多样性分析,采用牛津杯法测试细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。经形态学分析及16SrDNA比对,海绵中共获得34株共附生细菌,隶属于18科24属。活性检测结果表示,存在14株对甘蔗鞭黑粉菌有抑制效果的菌株。海绵中可培养共附生细菌物种多样性丰富,部分菌株的发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌具有较强的抑制效果,有成为新型生物农药的潜力。

一种甘蔗组培苗甘蔗鞭黑粉菌接种方法的建立

通过甘蔗鞭黑粉菌对甘蔗组培苗进行接种建立甘蔗鞭黑粉菌致病性测定方法,为提高甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突变体的筛选效率和致病性相关基因鉴定提供技术支持。利用甘蔗鞭黑粉菌209个突变体对移栽后高度为20~40cm的甘蔗组培苗进行一次初筛和一次复筛的致病性测定。结果表明,甘蔗鞭黑粉菌突变体最早发病时间为38天,甘蔗鞭黑粉菌野生型发病时间为48~72天。在初筛测试中,每处理只需1个重复(1株甘蔗组培苗),而在复筛中每处理仅需设5个重复。发病早、发病晚、不发病的突变体和正常发病的突变体,分别占突变体总数的1.9%、7.2%、0.5%和89.9%。该接种方法结果稳定,节约前期准备工作,缩短致病性测试周期,提高甘蔗鞭黑粉菌突变体致病性测试效率,对甘蔗鞭黑粉菌致病机理研究具有重要意义。

基于SSR标记的广东省甘蔗黑穗病菌遗传多样性研究

利用SSR标记分析了30个来自广东省甘蔗主产区的甘蔗黑穗病菌菌株的遗传多样性。用19对带型较稳定且条带清晰的引物从供试菌株群体中检测到了39个多态性位点,平均每个引物得到2.05条多态性带。UPGMA聚类分析表明,在约0.74的相似系数水平,SSR标记把30个菌株划分为5个类群,类群1有22个菌株,包含了绝大部分来自粤西和粤北的菌株及全部的广州市郊菌株;在约0.8的相似系数水平,类群1可以进一步分为2个亚群体,亚群体1包含了90%的粤北菌株,亚群体2则包含了50%的粤西菌株。研究结果表明:该菌的遗传多样性与菌株的地理来源呈显著相关,而与品种间的相关性不大。

甘蔗黑穗病及其病原菌研究进展

甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitaminea)引起的甘蔗黑穗病是一种世界性重要甘蔗病害,也是中国蔗区危害最严重的甘蔗病害,使甘蔗产量及品质均受到严重损失。综述甘蔗黑穗病病原特征、分类归属、生理分化、遗传多样性、快速检测,以及甘蔗黑穗病的发生危害及防治措施,并探讨进一步研究对策。

基于PCR和巢式PCR技术的甘蔗黑穗病早期检测

为了探索甘蔗黑穗病早期检测的可能性,应用本实验室已建立的甘蔗黑穗病菌PCR和巢式PCR检测技术,对经人工接种甘蔗黑穗病菌冬孢子的植蔗叶片进行检测,并调查采样植株的黑穗病实际发生情况。结果表明,黑穗病实际发生率80%(16/20),PCR检测阳性率35%(7/20),巢式PCR检测阳性率70%(14/20),PCR和巢式PCR检测为阳性的样品,其植株黑穗病发生率几乎为100%。这一结果表明了甘蔗黑穗病菌PCR和巢式PCR可用于甘蔗黑穗病早期检测,但巢式PCR检测结果与黑穗病的实际发生情况比较吻合,更适合于甘蔗黑穗病早期检测。另外,太幼小的甘蔗株(三叶期前),PCR和巢式PCR均不适合于甘蔗黑穗病早期检测。

甘蔗黑穗病及其防治研究进展

甘蔗是世界上重要的糖料和生物质能源作物,由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗黑穗病是甘蔗生产上的主要病害, 严重影响甘蔗产量和质量,对我国乃至世界甘蔗生产和蔗糖产业的可持续发展构成了严重威胁。在分子水平上甘蔗鞭黑粉菌致病机理和甘蔗抗病机理研究已成为当前研究的热点,深入的机理研究为甘蔗黑穗病的有效防治和抗病育种提供科学依据。目前,选育和推广抗黑穗病新品种是防治甘蔗黑穗病最经济有效的措施,而我国在抗病育种的研究基础比较薄弱。综述了甘蔗黑穗病发生与危害、病原特征、遗传多样性、致病机理、抗病育种及防治对策,并对甘蔗黑穗病研究中存在的问题与今后的研究思路进行了探讨与展望。

茅尾海无瓣海桑根际土壤细菌多样性及抑菌活性分析

【目的】研究茅尾海无瓣海桑根际土壤细菌多样性及抑菌活性,挖掘更多潜在新物种和高效活性物质,为进一步研究红树植物根际土壤中细菌的次生代谢产物及研发新型高效生物农药提供参考依据。【方法】从广西钦州茅尾海红树林保护区采集无瓣海桑根际土壤,采用6种分离培养基分离可培养细菌;通过16S r RNA基因序列的系统发育学分析其物种多样性,并采用牛津杯法考察根际细菌对甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性。【结果】从无瓣海桑根际中分离得到可培养细菌97株,通过16S r RNA序列比对排重后,从中获得57株不同细菌,可归为4门5纲9目15科21属,有1株Cellvibrio sp.的潜在新种。其中29株细菌能够抑制甘蔗鞭黑粉菌活性,分别有12、14和14株细菌对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长、"+"担孢子增殖和"-"担孢子增殖表现出抑制活性,抑菌圈直径范围为7.54~21.81 mm,其中有9株细菌能够抑制2~3种甘蔗鞭黑粉菌的形态。【结论】广西茅尾海红树林保护区中无瓣海桑根际细菌具有较高的物种多样性,蕴藏着潜在新物种资源,且富含抑菌活性菌株。

甘蔗鞭孢堆黑粉菌原生质体转化DNA双片段的基因敲除方法的建立

由甘蔗鞭孢堆黑粉菌Sporisoriumscitamineum引起的甘蔗黑穗病是甘蔗生产的主要病害,严重影响了甘蔗的产量和品质,然而其分子致病机制报道很少,极大地影响了有效防控技术的开发。为了提高该病菌基因功能的研究效率,本研究以甘蔗鞭孢堆黑粉菌有性配合两个关键基因SsGPA3和SsPRF1为目标,建立了基于DNA双片段的甘蔗鞭孢堆黑粉菌原生质体转化基因敲除技术体系。结果表明甘蔗鞭孢堆黑粉菌单倍体细胞生长期在OD600约为0.7,28℃下10mg/mL细胞壁裂解酶作用30min获得的原生质体产率最高,再生率最优;使用线性DNA双片段转化获得阳性转化子的成功率达90%以上,显著高于线性DNA单片段和质粒。本方法的建立将极大地提高甘蔗鞭孢堆黑粉菌的基因敲除效率,同时也为其他真菌的基因敲除提供借鉴。

siRNA介导的甘蔗鞭黑粉菌基因沉默方法的建立

甘蔗是全世界最重要的糖料作物。由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗黑穗病是一个全球性的病害,对甘蔗生产造成巨大危害。RNA干扰技术是一种快速有效的研究基因功能的方法,然而尚没有在甘蔗鞭黑粉菌中利用RNA干扰研究基因功能的报道。本研究以荧光蛋白基因eGFP为靶标,构建了表达eGFP的菌株JG35-eGFP和含有eGFP基因回文序列的干扰菌株JG36-eGFP-RNAi,将其进行有性配合,结果显示,eGFP基因表达量及荧光强度均显著下降,表明甘蔗鞭黑粉菌的RNA干扰系统构建成功。我们用此干扰系统对甘蔗鞭黑粉菌的效应物基因g2476的功能进行研究,发现目的基因在单倍体及有性配合形成的菌丝中表达水平均明显下调,但RNA干扰单倍体的有性配合能力并无明显变化。甘蔗鞭黑粉菌中RNA干扰方法的建立为该菌基因功能研究提供了新的工具,并为培育HIGS(Host induced gene silencing)抗病植株奠定了基础。

甘蔗鞭黑粉菌侵染甘蔗的早期可视化观察

【目的】甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗黑穗病是我国甘蔗生产重要的病害。示踪甘蔗鞭黑粉菌侵染甘蔗的过程将有助于揭示其致病性和甘蔗抗黑穗病机制,为抗病品种的选育以及黑穗病的防治奠定基础。【方法】利用农杆菌介导的遗传转化技术对甘蔗鞭黑粉菌进行黄色荧光标记,对转化子进行配合及致病力检测,将标记菌株接种甘蔗感病品种ROC22及抗病品种中蔗1号、中蔗6号和中蔗9号并进行早期可视化观察。【结果】组成型表达的eYFP不影响标记菌株的配合及致病能力,而且黄色荧光性状能通过冬孢子稳定遗传。激光共聚焦显微观察表明,注射接种病原菌第5天,在感病品种ROC22的生长点已可见荧光菌丝及少量聚集状菌丝体,在抗病品种中蔗1号、中蔗6号和中蔗9号中可见少量单一丝状菌丝,无聚集状菌丝体。接种后35 d,在ROC22中可见大量聚集状菌丝体,但在中蔗品种中的聚集状菌丝体明显较少,而以中蔗1号最少。【结论】成功构建了甘蔗鞭黑粉菌侵染甘蔗的荧光示踪系统,并发现中蔗系列品种存在抑制甘蔗鞭黑粉菌菌丝体在细胞间扩展的机制。

核转运蛋白SsKapM涉及调控甘蔗鞭孢堆黑粉菌的菌丝生长

核转运蛋白是真核生物中负责大分子物质进出核孔的重要载体,承担着维持正常生命活动的任务。本研究通过序列同源比对鉴定了甘蔗鞭孢堆黑粉菌核转运蛋白编码基因,根据注释命名为SsKapM。使用同源重组方法对SsKapM进行敲除后,发现ΔSsKapM突变体担孢子的生长速率、适宜的生长温度、有性配合/菌丝生长等方面均发生改变。研究中还发现SsKapM缺失会导致双核菌丝体对高浓度磷酸盐敏感性下降。同时,通过转录组数据分析探究SsKapM的功能机制。结果表明SsKapM调控热激反应、磷酸盐信号与转运通路等基因的表达。这一发现将为甘蔗鞭孢堆黑粉菌的防治提供新的思路。

核转运蛋白SsKapJ调控甘蔗鞭孢堆黑粉菌有性配合与菌丝生长

为了研究核转运蛋白SsKapJ在甘蔗鞭孢堆黑粉菌中发挥的作用,本研究利用PEG介导的原生质体转化方法获得基因敲除突变体,并进行了相关生物学表型分析。结果显示潜在核转运蛋白基因SsKapJΔ突变体有性配合和菌丝生长显著减弱,转录组分析SsKapJ参与环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径调控。另一方面,SsKapJΔ突变体担孢子对吡唑醚菌酯杀真菌剂敏感性增强,但突变体对苯菌灵杀真菌剂敏感性以及环境胁迫测试(渗透压、细胞壁抑制剂、氧化还原和乙醇)中较野生型没有明显变化。本研究结果揭示了SsKapJ核转运蛋白在甘蔗鞭孢堆黑粉菌的有性配合和菌丝生长过程中具有重要调控作用,为后续开展核运输途径调控真菌有性配合/二态型转变研究提供基础。