PEG-6000模拟干旱胁迫对甘薯近缘野生种Ipomoea trifida (Kunth) G.Don幼苗生理生化指标的影响

Ipomoea trifida(Kunth)G.Don(2n=2x=30)是甘薯祖先种之一,具有较强的抗旱性,其抗旱生理机制尚无报道。本文采用营养液水培法,以30%浓度的PEG6000模拟干旱,研究干旱胁迫对甘薯近缘野生种幼苗叶片生理生化指标的影响。结果表明:随着PEG6000干旱胁迫时间的延长,叶片中丙二醛(MDA)、游离脯氨酸(Pro)含量逐渐增加。过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽还原酶(GR)活性在PEG处理后活性均增强,揭示了甘薯近缘野生种MDA和Pro含量和氧化酶类的活性在短时间急性胁迫情况下的不同变化规律,可为抗旱品种的筛选和下一步抗旱相关基因的挖掘提供一定的参考。

甘薯近缘野生种Ipomoea trifida(4 x)的染色体核型分析

采用染色体常规压片法,对甘薯近缘野生种Ipomoea trifida(4 x)的染色体数目及核型进行分析。结果表明,甘薯近缘野生种Ipomoea trifida(4 x)的染色体数目为2 n=4 x=56,相对长度介于(23±6.93)^(26±5.96)之间,臂比范围介于(1.20±0.36)^(3.64±0.36)之间,核型不对称系数为58.22%,核型分类属3 A型,其核型公式为:2 n=4 x=56=6 m+4 sm+1 st+3 t。染色体主要由中部着丝点染色体组成。

甘薯近缘野生种Ipomoea triloba L.干旱响应基因ItHAP2的克隆及表达分析

避旱性是植物重要的干旱响应机制,其重要表现就是早花。甘薯近缘野生种I.triloba(三裂叶薯)中包含大量的优良抗旱基因,本研究室前期对甘薯栽培种高系14号、I.triloba以及二者的体细胞杂种KT1三者进行了PEG干旱胁迫转录组测序,并通过Weighted Gene Co-expression Network Analysis(WGCNA)方法从测序数据中分析得到了两个和抗旱性关联度较高的干旱响应基因模块。本研究利用实时荧光定量PCR的方法对模块中的基因进行了干旱胁迫表达验证,筛选并克隆到一个与雌雄配子体融合相关的基因ItHAP2,该基因表达受到PEG胁迫的强烈诱导且在I.triloba的花中具有较高表达量。ItHAP2基因的开放阅读框为2 058 bp,基因组序列为5 688 bp,具有17个外显子和16个内含子。ItHAP2蛋白具有HAP2-GCS1特征结构域以及一个跨膜结构域,亚细胞定位于细胞膜,综合分析表明ItHAP2基因同I.triloba的避旱性早花有关。本研究进一步阐明了I.triloba具有良好抗旱性的分子基础以及I.triloba相较于甘薯栽培种在自然条件下更易开花结实的特性。

甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛WRKY基因家族的生物信息学分析

WRKY基因家族是一类含有WRKY保守结构域的转录因子大家族,是植物中最大的转录调控因子家族之一。目前已有多种植物WRKY家族的分析鉴定报告,但关于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)中WRKY家族的报告却很少。本研究利用生物信息学方法对甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛Ipomoea trifida(Kunth)G.Don的基因组数据进行了详细的分析,结果显示:在三浅裂野牵牛基因组中共鉴定得到82个WRKY转录因子,其中81个不均匀分布在基因组的15条染色体上,第5号染色体上分布最多(10个基因),第8和15号染色体上分布最少(2个基因);蛋白分子大小在116~710个氨基酸之间,等电点为4.85~10.33不等;按照保守结构域分类可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组,Ⅱ组包含Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe五个亚组,其中Ⅰ组有15个ItWRKY基因、Ⅱa组4个、Ⅱb组11个、Ⅱc组23个、Ⅱd组7个Ⅱe组10个、Ⅲ组12个;82个ItWRKY基因中有8个基因的核心结构域WRKYGQK发生了单个氨基酸变化(WRKYGKK)。ItWRKY基因以组织特异性的方式表达且在不同胁迫下基因的表达量存在差异,表明ItWRKY基因参与了三浅裂野牵牛对胁迫的响应。本研究为甘薯WRKY基因的功能鉴定提供了参考作用,进一步为甘薯的分子育种提供了帮助。

甘薯近缘种Ipomoea trifida (Kunth) G.Don基因组Fosmid文库构建及PCR筛选体系建立

为挖掘有价值的基因资源,对甘薯近缘种I.trifida的基因组文库进行了研究。通过流式细胞法测定I.trifida（2x,编号DLP4597）基因组大小为531.699 Mb。以叶片为材料采用包埋法提取基因组DNA,通过物理剪切进行基因组DNA片段化并进行末端平滑化和磷酸化处理,脉冲场电泳回收33-48 kb的DNA片段,然后连接到Fosmid载体pCC1FOS（Epicentre）上,包装转化大肠杆菌EPI300,构建了I.trifida的基因组Fosmid文库,该文库包含101 952个单克隆,保存于1 062个96孔培养板中,平均插入片段35 kb,覆盖基因组约6.7倍,理论上任意片段筛出率达到99.88%。以20个96孔板为一组构建三维PCR筛选体系,共分为53个组（第53组包含22个96孔板）,每组包含1个超级池,20个板池,12个列池,8个行池,理论上最多通过93个PCR反应即可筛选到1个阳性单克隆。随机选择来自I.trifida的10个基因进行文库克隆筛选,平均阳性克隆数为8.2个,最少阳性克隆数为3个,最多为16个。