ConA识别的高甘露糖型糖蛋白在肿瘤患者血清中表达的研究

目的研究ConA识别的高甘露糖型糖蛋白在鼻咽癌、肺癌、肝癌和结直肠癌患者血清中的表达规律。方法应用ConA(刀豆凝集素)亲和层析法从正常人血清中获得ConA识别的高甘露糖型糖蛋白。结果ConA识别的高甘露糖型糖蛋白明显高于正常人和良性疾病患者,阳性率分别为77.4%,65.2%,70.3%;鼻咽癌患者血清阳性率为21.4%。且在结直肠癌患者有效治疗后该糖蛋白水平显著下降,阳性率也下降。结论血清中ConA识别的高甘露糖型糖蛋白,可用于肿瘤患者血清糖基化异常和肿瘤发病机理的研究,并可为临床诊断和治疗效果的评价提供参考指标。

Man_5GlcNAc_2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建

蛋白的糖基化对蛋白的活性、高级结构及功能都有重要的影响。酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白,而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化,获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01(ura3、och1)的基础上,通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I(MDSI)的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白,并通过DSA-FACE(基于DNA测序仪的荧光辅助糖电泳)分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF(人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白)的糖基结构,发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时,毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。

鹅颈藤壶多糖提取、理化性质及N-糖链表达谱分析研究

本文以南海海域鹅颈藤壶(Lepas anatifera)为原料,提取鹅颈藤壶背甲与肌肉质柄中的多糖,基于其基本理化性质的分析,比较不同生长时期鹅颈藤壶N-糖链表达谱的差异性。经过脱脂、碱水解/蛋白酶解、乙醇沉淀方法提取得到粗多糖;利用高效液相色谱法、高效凝胶渗透色谱法、苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法对其单糖组成、分子量分布、总糖含量及蛋白质含量进行分析;采用液质分析(PGC-ESI-MS/MS)方法对鹅颈藤壶成体(A-GB)与幼体(L-GB)肌肉质柄中N-糖链进行分析并比较。表明肌肉质柄中多糖分子量为18.40 kDa;总糖含量为11.99%,蛋白质含量60.14%,富含甘露糖、葡萄糖、氨基半乳糖,其中甘露糖的含量高达80%以上。在鹅颈藤壶成体与幼体中均鉴定得到26条N-糖链,成体中高甘露糖型N-糖链占总糖链的20.81%,且相对丰度较高的糖型组成为F_(1)H_(3)N_(2)(39.06%)、F_(1)H_(3)N_(3)(24.44%)、H_(3)N_(3)(9.35%);幼体中高甘露糖型N-糖链占总糖链的52.17%,相对丰度较高的糖型组成为F_(1)H_(3)N_(2)(21.65%)、H_(6)N_(2)(15.93%)、H_(5)N_(2)(14.75%)。鹅颈藤壶多糖是一类N-糖基化的蛋白复合物,推测N-糖链在鹅颈藤壶长发育过程中发挥着至关重要的作用,可能高甘露糖型N-糖链与其附着黏附能力密切相关。

半湿法分离提取半乳甘露聚糖型植物胶

本文叙述了半湿法分离提取植物胶的生产方法、工艺特点以及原料要求。

氧化型甘露聚糖修饰的LL/2c肿瘤细胞疫苗诱导Th1免疫反应

目的 :观察氧化型甘露聚糖修饰的LL/2c肿瘤细胞疫苗 (oxidativemannan -conjugatedLL/2c,ox-M -L)能否诱导Th1抗瘤免疫反应。方法 :乙醇固定的LL/2c细胞 (fixedLL/2c ,f-L)、ox -M -L腹腔免疫小鼠 ,取脾脏制备T淋巴细胞悬液 ,采用ELISA检测体外刺激的T细胞INF -γ、IL - 4分泌 ,51Cr释放实验观察CTL(cytotoxicTlymphocytes,CTL)杀伤活性。结果 :ox -M -L免疫小鼠的T细胞经丝裂霉素C预处理的LL/2c体外刺激 ,其INF -γ分泌显著提高 :51Cr释放实验显示出对LL/2c细胞特异性的CTL杀伤活性 ,且这种杀伤活性具有CD8+T细胞的依赖性。未修饰的LL/2c免疫小鼠的T细胞诱导了较高的IL - 4分泌 ,但未显示出CTL杀伤活性。结论 :LL/2c肿瘤细胞作为抗原 ,经氧化型甘露聚糖修饰有效的诱导了Th1类型的抗瘤免疫反应。

猪链球菌2型05ZYH33糖苷水解酶SSU05_1921和SSU05_1922的表达纯化及功能研究

为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株高甘露糖型N-聚糖水解酶的结构域及功能,本研究通过BLAST检索,发现该菌株中存在分别与肺炎链球菌高甘露糖型N-聚糖水解酶SpGH92和EndoD同源的蛋白,分别为SSU05_1921(后简写为1921)和SSU05_1922(后简写为1922)。本研究通过原核表达系统和Ni-NTA柱亲和层析纯化,获得了1921和1922全长蛋白,以及1922蛋白的糖苷水解酶结构域1922-Cat。通过6个蛋白反应(不加蛋白的阴性对照、分别仅加1921和1922的蛋白反应2、3,同时加入1921和1922的蛋白反应4、5及同时加入1921和1922-Cat的蛋白反应6)的RNase B去糖基化试验,反应结束后分别通过SDS-PAGE及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析RNase B的水解(即去糖基化)产物,研究1921和1922水解高甘露糖型N-聚糖的功能。结果显示,1921为外切α-1,2-甘露糖苷酶,水解RNase B高甘露糖型N-聚糖末端的α-1,2-甘露糖苷键;1922为内切β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,水解RNase B高甘露糖型N-聚糖中的几丁二糖,作用位点为β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷键。且只有在1921去除所有的α-1,2-甘露糖苷键,1922才能彻底水解高甘露糖型N-聚糖。二者的联合作用(反应4)结果显示,在15 ku处出现单一条带,表明二者联合作用于RNase B的高甘露糖型N-聚糖后,将其彻底去糖基化为R-GlcNAc,且1921与1922-Cat的联合作用与上述联合作用结果一致,表明1922的主要催化结构域即为1922-Cat。因此选择1921与1922-Cat联合作用于RNase B的去糖基化反应研究不同pH、不同金属离子及EDTA和EGTA螯合物对该联合作用的影响。结果显示,该联合作用的最适pH为7.0~8.0,二价金属离子Cu^(2+)、Fe^(2+)、Ni^(2+)、Co^(2+)、Zn^(2+)均明显抑制1921与1922-Cat的联合作用,Ca;部分抑制该联合作用,而二价离子Mg;、Mn;和一价离子K^(+)、Na^(+)及二价金属离子螯合物EDTA和EGTA对该联合作用无明显抑制作用,表明1921和1922-Cat的联合作用不依赖于二价金属离子。本研究首次较详细探究了SS2高甘露糖型N-聚糖水解酶的功能和生化特性,为解析SS定植和感染过程中糖类营养物质获取的机制奠定了基础。

酵母N-糖基化工程研究进展

酵母表达系统可用来生产具生物活性的重组糖蛋白,但其在N-糖基化过程中会生成高甘露糖型糖链。通过引入相关的甘露糖苷酶和糖基转移酶基因、切断酵母自身的高甘露糖链形成通道能够改变酵母宿主N-糖基化的类型。本文对酵母N-糖基化工程的研究状况、最新进展及存在问题作简要阐述。

MEL-A-ZnONPs的制备、表征及抗菌活性研究

为提高纳米氧化锌(zinc oxide nanoparticles,ZnONPs)的分散性和抗菌活性,该研究将绿色、无毒的A型甘露糖赤藓糖醇脂(mannosylerythritol lipids-A,MEL-A)用于ZnONPs的制备和修饰,并利用紫外可见光谱、X射线衍射、傅里叶红外光谱、纳米粒度、Zeta电位和透射电镜-能谱等方法进行表征。结果表明,MEL-A添加浓度为0.250 mmol/L时,制备出的0.250MEL-A-ZnONPs平均粒径及多分散系数(polydispersity index,PDI)值最小,分别为(78.25±27.26)nm和0.155,Zeta电位的绝对值达到最大,为-22.89 mV,且透射电镜形貌及分散性最好,显著优于未修饰的对照组(N-ZnONPs)。利用最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)、最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)、生长曲线、抑菌圈等实验评价ZnONPs的抗菌性能,发现N-ZnONPs和0.250MEL-A-ZnONPs对金黄色葡萄球菌的MIC均为12.0 mg/L,MBC分别为24.0 mg/L和16.0 mg/L,对大肠杆菌的MIC分别为24.0 mg/L和20.0 mg/L,MBC分别为32.0 mg/L和24.0 mg/L,表明MEL-A-ZnONPs对金黄色葡萄球菌具有更好的抗菌效果。

鲤多拷贝基因MRC1的全基因组鉴定及表达分析

甘露糖受体C1型基因(mannose receptor C-type 1,MRC1)是C型凝集素超家族的成员之一,其编码的甘露糖受体是一种模式识别受体,在先天免疫反应中发挥关键作用。MRC1基因在哺乳动物免疫反应中的作用被广泛研究,但在鱼类中的研究较少。近年来,随着高密度集约化养殖模式的发展,由病原微生物引发的疾病频繁暴发,其中,嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是常见的致病菌之一。本研究首次在鲤(Cyprinus carpio)全基因组范围鉴定MRC1基因,共发现11个基因拷贝,并进行了功能域预测、共线性分析、多序列比对和系统进化分析,结果表明,MRC1基因在物种进化过程中保守程度较高。拷贝数比较分析发现,MRC1基因在不同物种中表现出不同程度的多拷贝现象,在多数鱼类中发现2个拷贝,而在鲤中发现多达11个拷贝。同时,比较了各拷贝在健康鲤脑、肌肉、肝脏和脾脏组织中的表达情况,发现在免疫相关组织脾脏中的表达量相对高于其他组织。进一步对感染嗜水气单胞菌4、12、24 h后在鲤脾脏中的表达进行差异比较分析,发现不同拷贝的表达特征各有差异,其中,HHLG13g0734在感染嗜水气单胞菌4 h后表达显著上调,HHLG13g0734在感染24h后表现出极显著上调,HHLG3g0497在整个感染过程中表达显著下调,表明鲤MRC1基因只有部分拷贝保留了免疫相关功能及参与机体的免疫反应。本研究结果有助于进一步了解鲤MRC1基因在抵抗嗜水气单胞菌感染过程中发挥的免疫功能,并为分子选育抗病新品系提供一定的数据基础。

运用全因子试验方法优化单抗生物类似药生产过程中的糖基化分布

旨在调控单抗生物类似药的糖基化分布,使其与原研药一致。通过全因子设计试验考察不同浓度的半乳糖、尿苷、氯化锰和蛋白水解物对单抗糖基化修饰的影响。结果表明,半乳糖、尿苷及氯化锰均能提高单抗半乳糖基化,且对细胞生长和单抗产量无明显影响。此外尿苷和氯化锰还能降低五聚高甘露糖型(Man5),但过量的尿苷会导致Man5增高。而蛋白水解物除了能降低Man5,提高单抗岩藻糖基化外,对细胞生长也有促进作用。选取模型预测的最优条件进行反应器培养验证,最终的单抗糖基化分布符合预期,成功建立CHO细胞单抗糖基化调控的生产策略。

食管鳞癌中差异表达的N-连接糖蛋白鉴定

目的应用二维电泳和质谱技术鉴定食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中差异表达的N-连接糖蛋白。方法采用串联植物凝集素亲合层析法分离纯化ESCC与癌旁食管黏膜组织中高甘露糖型和唾液酸型N-连接糖蛋白,二维电泳、串联质谱鉴定差异表达的蛋白质分子;Western blot验证候选蛋白质分子在ESCC中的差异表达。结果鉴定了22种高甘露糖型和23种唾液酸型差异表达的N-连接糖蛋白,Western blot证实在ESCC中补体C3(completment C3)高表达、触珠蛋白(haptoglobin,HP)和聚集素低表达。结论ESCC中存在N-连接糖蛋白变异,异常糖基化的HP、聚集素和补体C3及相应的糖链变异是ESCC潜在的生物标志物。

2型糖尿病血清Afamin蛋白组学研究

Afamin是与2型糖尿病(T2DM)密切相关的糖蛋白,本研究主要利用免疫印迹(Western Blot)和酶联免疫(ELISA)的方法研究T2DM血清Afamin的变化趋势,并进一步利用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)方法以及免疫印迹的方法探讨并验证T2DM病人血清中Afamin糖基化修饰状态的变化。结果显示,T2DM病人Afamin条带灰度较健康对照显著增强(p=0.0101),血清Afamin在T2DM组和健康对照组浓度分别6.03±0.19μg/mL和5.07±2.12μg/mL,且两组之间具有显著性差异(p=0.0019);在Afamin高甘露糖型糖基化修饰异质性分析中,原血清以及Con A洗脱蛋白质中均检测到Afamin,而流穿蛋白质中未检测到Afamin,即所有血清Afamin都存在高甘露糖型糖链;iTRAQ标记定量数据显示血清高甘露糖型Afamin在T2DM中发生显著性上调,Western Blot结果验证了这一变化趋势(p=0.0462)。

解聚型魔芋葡甘露聚糖的制备以及生理活性研究的进展（英文）

魔芋葡甘露聚糖是从魔芋块茎中提取的一种高分子水溶性多糖。近些年研究表明,其解聚产物,除了具有高溶解性和低粘度等良好的理化性质外,还具有调节微生物菌群结构、抗氧化、免疫调节等多种生理活性。本文重点综述了解聚型葡甘露聚糖的制备方法以及菌群调节功能。除此之外,对其抗氧化、免疫调节功能以及安全性评价也进行了全面的总结,为解聚型葡甘露聚糖的研究与应用提供一定的依据与思路。

OX-M-AdmCLB1重组腺病毒制备及其诱导的体内抗肿瘤效应

构建小鼠细胞周期蛋白B1(mcyclinB1)重组腺病毒(AdmCLB1),将氧化型甘露聚糖(OX-M)与AdmCLB1偶联,制备OX-M-AdmCLB1,研究OX-M-AdmCLB1诱导的抗肿瘤效应。利用AdEasy系统构建携带靶基因小鼠细胞周期蛋白B1的复制缺陷型重组腺病毒AdmCLB1,抽提AdmCLB1基因组DNA,进行PCR扩增。重组病毒经扩增、纯化后与OX-M混合,制备OX-M-AdmCLB1;OX-M-AdmCLB1体外感染小鼠树突状细胞(DC),RT-PCR扩增分析靶基因表达;OX-M-AdmCLB1处理BALB/C小鼠,处理后再荷瘤,观察小鼠肿瘤生长及生存情况。重组病毒AdmCLB1终滴度为2.1×1011pfu/ml;DC内靶基因的表达量在OX-M-AdmCLB1组较AdmCLB1组高;体内研究提示OX-M-AdmCLB1可明显抑制CT26肿瘤增殖(抑瘤率44%)、延长动物生存期(P<0.01)。实验制备的新型重组腺病毒OX-M-AdmCLB1体内能够诱导明显的抗肿瘤效应,估计此效应的产生与DC特异识别OX-M-AdmCLB1,进而激活机体抗肿瘤免疫有关。

MPDU1基因在杜洛克猪和长白猪群体内的多态性

本实验采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术分析猪MPDU1基因的多态性,并检测该基因在杜洛克猪和长白猪群体内的基因型频率和等位基因频率。结果表明,MPDU1基因在2个猪群体内呈现3种基因型(TT、TC和CC)。在杜洛克猪群体内TT、TC和CC的基因型频率分别为0.034、0.391和0.575,T和C等位基因频率分别为0.230和0.770;在长白猪群体内TT、TC和CC的基因型频率分别为0.014、0.125和0.861,T和C等位基因频率分别为0.076和0.924。

杂色鲍两种perlucin基因的克隆与表达分析

利用SMART RACE技术克隆杂色鲍两个甘露聚糖结合型凝集素(mannan-binding lectin,MBL)成员perlucin1和perlucin4基因的全长c DNA序列,使用Real time PCR分析这些基因在杂色鲍不同组织中的表达。结果显示,杂色鲍perlucin1 c DNA序列全长为668 bp,165个氨基酸,经分析该基因含有2个二硫键、2个糖基化位点和13个磷酸化位点,预测蛋白分子量约为18.8 k D,等电点约为4.57;perlucin4 c DNA序列全长为587 bp,156个氨基酸,含有2个二硫键、1个糖基化位点和7个磷酸化位点,预测蛋白分子量约为17.8 k D,等电点约为4.43;鳃、肝胰腺、血淋巴、上足、外套膜、黏液腺、肾脏7个组织中,perlucin1基因和perlucin4基因只有在肝胰腺中表达,在其它组织中没有检测到表达。结果表明,perlucin基因参与了杂色鲍天然免疫防御机制,在免疫识别中发挥着重要作用。