血清半乳糖缺陷型IgA1和甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶3在IgA肾病发病机制中的研究进展

IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病,是导致终末期肾病的常见原因。目前,肾活检仍然是其诊断和评估病情活动的金标准。已有研究显示半乳糖缺陷型IgA1(galactose-deficient IgA1,Gd-IgA1)的沉积在IgAN致病过程中发挥重要作用,GdIgA1的沉积会激活补体系统,包括替代途径、凝集素途经和经典途径,甘露糖结合凝集素是凝集素途径起始的关键因子,活化的甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶(mannose binding lectin-associated serine protease,MASPs)是凝集素途径的关键酶,MASPs存在三种不同的亚型(MASP1、MASP2、MASP3),MASP3作为一种新型的MASP蛋白酶,成为近期研究热点,国内外多项研究表明MASP3能够激活D因子,参与替代途径,造成肾小球系膜细胞的损伤。因此Gd-IgA1的沉积与MASP3地出现在IgAN当中可能存在一些联系,有待于进一步的实验研究。本文旨在系统综述GdIgA1、MASP3在IgAN的发病机制中的作用,并探讨Gd-IgA1与MASP3之间的相关性。

草鱼丝氨酸蛋白粗酶的提取、酶学特性及大豆胰蛋白酶抑制剂对其活性的影响

【目的】探究草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)粗酶的提取方法、酶学特性,以及大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对草鱼鱼糜凝胶品质的影响,为改善传统草鱼鱼糜制品品质提供理论基础。【方法】从草鱼背肌中提取MBSP粗酶液,探究提取过程中漂洗次数(1~5次)、热处理温度(35、40、45、50、55℃)、酸洗脱pH值(pH 4.0、pH 5.5)对提取液酶活性的影响,获得最佳提取条件;设置梯度实验探究所得酶的最适温度、pH、稳定性等酶学特性,最后探究大豆胰蛋白酶抑制剂对粗酶酶活性的影响及其对草鱼鱼糜凝胶性能的调控。【结果及结论】经3次漂洗、45℃热处理、pH 4.0酸洗脱后得到的草鱼MBSP粗酶液酶活性最高(P<0.05);所得MBSP最适pH值在9.0附近,最适温度为45℃,具有较好的温度稳定性(P<0.05),其活性可被Na^(+)在一定程度上抑制且被K+、Ca^(2+)激活(P<0.05);STI添加可以显著改善草鱼鱼糜质构,其对草鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶有可逆竞争性抑制作用,半抑制质量浓度为10.85μg/mL,抑制常数Ki=0.24μmol/L。

人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2N端片段的原核表达

目的在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶2(MASP2)N端片段。方法应用PCR技术从含人MASP2 cDNA的质粒pGEM-MASP2中扩增MASP2-N端基因片段,将其克隆至pGEX4T-1原核表达载体,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP2-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与MBL-CLR结合的活性。结果从pGEM-MASP2中扩增得到约840 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4900 bp和840 bp片段,测序结果与预期的完全一致。纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr 60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR蛋白结合。结论获得了表达人MASP2 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP2N端片段/GST融合蛋白,为MASP2分子的进一步研究提供了条件。

人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2基因的克隆与鉴定

目的 获得人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶－２（ＭＡＳＰ－２）编码区基因。方法采用 ＲＴ－巢式 ＰＣＲ技术从 人胎肝组织总ＲＮＡ扩增目的cＤＮＡ片段，克隆人ｐＧＥＭ－Ｔ载体，酶切图谱分析和测序鉴定。结果获得了编码合信号 顺序的ＭＡＳＰ－２肽链全长cＤＮＡ，将其与pＧＥＭ－Ｔ载体连接，转化大肠杆菌ＴＧ１，建立了ＭＡＳＰ－２的重组克隆。酶切图 谱与微机分析结果无异；序列分析表明，与报道的人 ＭＡＳＰ－２ｃＤＮＡ序列一致。结论成功克隆了人 ＭＡＳＰ－２基因，为深 入研究补体凝集素途径的激活机制和甘露聚糖结合凝集素基因突变引起免疫缺损的发病机制奠定了基础。

甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶

甘露聚糖结合凝集素 (MBL)是一种重要的天然免疫防御分子 ,通过激活MBL相关丝氨酸蛋白酶 (MASP)而启动补体激活凝集素途径来清除病原体。本文就MASP的基因。

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶与相关疾病最新研究进展

恶性肿瘤与自身免疫性疾病的发病率逐年增高,国内外学者的目光逐渐聚焦在天然免疫这一方面。补体系统则是天然免疫中的关键环节,其在疾病发生、发展过程中所起作用也越来越受到重视。补体是存在于人或动物血清中一组不耐热的且具有酶活性的蛋白质,并非单一分子,是由30多种蛋白成分组成的限制性蛋白酶解系统,又称为补体系统。广泛参与机体的多种免疫效应机制。补体需要被激活才能发挥其相应的生物学作用。

肝细胞肝癌患者血浆中甘露聚糖结合凝集素和甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2的表达水平

目的检测肝细胞肝癌患者血浆中甘露糖结合凝集素(MBL)、MBL相关丝氨酸蛋白酶-2(MASP-2)的表达水平,探讨其与肝细胞肝癌发生发展的相关性。方法用酶联免疫吸附测定方法检测64例肝细胞肝癌患者及30例健康人血浆中MBL及MASP-2的表达水平,并用统计学方法分析患者血浆中MBL及MASP-2的浓度与各临床指标的相关性。结果肝细胞肝癌患者血浆中MBL和MASP-2的浓度均显著高于健康人群(P=0.014、0.002),MBL/MASP-2比值在健康人群与肝细胞肝癌患者中的差异无统计学意义,此外,患者血浆中MBL与MASP-2并无相关性。在肝细胞肝癌患者中,血浆MBL水平与肿瘤的血管侵犯(r=0.253,P=0.047)和总胆红素水平(r=0.283,P=0.024)呈正相关;血浆中MASP-2水平与肝细胞肝癌的TNM分期呈正相关(r=0.276,P=0.027),而与血浆白蛋白呈负相关(r=0.-0.317,P=0.015)。经ROC曲线分析,MBL和MASP-2曲线下面积分别为0.665(P=0.010)和0.694(P=0.003),对肝细胞肝癌诊断的敏感性分别为50%和89.1%。结论补体凝集素途径的关键分子MBL、MASP-2与肝细胞肝癌患者的炎症状态和疾病进展相关,参与了肝癌的发生与发展。

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2的研究进展

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP-2)是补体凝集素途径关键酶,位于染色体1p36上,约20 kb,由686个氨基酸残基构成。通过病原相关分子模式识别病原体,与凝集素结合,以酶原形式存在的MASP-2活化,继而激活后续级联反应,致使入侵的病原体被机体清除破坏。MASP-2基因多态性普遍存在,过高或过低的MASP-2水平都不利于免疫系统正常运行,影响着多种疾病的易感性及发展进程。MASP-2血清浓度在不同疾病及同一疾病不同阶段的不尽相同。MASP-2与肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的发生发展密切相关。

甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶3的研究现状

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶3(MASP3)是补体凝集素途径的酶成分之一,由MASP1/3基因编码。既往资料证实,MASP3不参与凝集素途径活化,对补体蛋白C3、C4以及C2均无酶切活性,而近期研究表明MASP3是参与补体D因子活化的关键酶,进而可能是联系补体凝集素途径和旁路途径活化的重要成分。此外,人们通过动物疾病模型研究发现MASP3可能作为补体旁路途径异常相关疾病的新治疗靶点,从而为相关疾病提供新的治疗思路。本文旨在对MASP3的编码基因、蛋白结构、生物学功能以及其在旁路途径功能异常相关疾病模型中的研究进展进行综述。

鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的结构建模、内源抑制剂对接及其钙结合机制

【目的】分析鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(Myofibril-bound serine proteinase,MBSP)结构的基础特性。【方法】使用AlphaFold2对鲢MBSP进行结构建模,通过保守性分析、静电势计算、分子对接等手段探讨鲢鱼MBSP的结构特征,并借助分子动力学模拟研究钙结合对其结构的影响。【结果与结论】鲢鱼MBSP的活性酶形式含222个残基,有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的典型结构特征,但表面充斥着更多赖氨酸,使其表面“粗糙”且利于离子键形成。62Asn及61Glu是其关键的钙结合位点,钙结合导致的结构变动可传至C端,40His、自溶环、氧阴离子稳定环等关键区域的柔性变化是钙激活机制中的重要部分。葡萄糖-6-磷酸异构酶二聚体上的10Arg及17Lys是参与鲢鱼MBSP底物结合竞争的潜在关键位点。除催化活性口袋外,潜在的变构位点亦是MBSP抑制剂设计的可选出发点。

甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2 EGF片段多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MBL-associated serine protease-2,MASP-2)EGF功能区蛋白的多克隆抗体并进行鉴定,为后续研究奠定基础。方法利用带有EGF基因片段的p GEX-6P-2原核载体诱导表达GST-EGF融合蛋白,并采用商品化GST-Beads进行纯化;将纯化的融合蛋白作为抗原,与弗氏完全佐剂充分混合后,免疫5周龄BALB/c雌性健康小鼠,制备多克隆抗体;利用琼脂双扩散法检测多克隆抗体的效价,并进一步应用Western blot鉴定多克隆抗体的特异性及效价。结果成功表达并纯化EGF蛋白,以此成功制备出特异性强的GST-EGF融合蛋白的多克隆抗体,与其他蛋白无交叉反应;琼脂双扩散法检测的EGF抗体效价为1∶8;Western blot检测的EGF抗体效价大于1∶2 000。结论成功制备出具有特异性强且效价高的GST-EGF蛋白的多克隆抗体。

发热性中性粒细胞减少白血病患儿血浆人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2水平分析

全球范围内由于恶性肿瘤而接受化疗的患者中中性粒细胞减少极其常见，不明原因的发热是这些患者感染时的唯一征象。感染以及感染所引起的并发症是白血病患儿高发病率和高病死率的一个主要原因。

甲状腺肿瘤患者血清中甘露糖结合凝集素和相关的丝氨酸蛋白酶-2的水平及意义

目的探讨甲状腺肿瘤患者血清中甘露糖结合凝集素和相关的丝氨酸蛋白酶-2的水平及意义。方法 24例甲状腺乳头状癌患者(乳头状癌组)、28例甲状腺腺癌患者(腺癌组)及26例正常健康人作为对照(对照组),采用酶联免疫吸附法分别检测患者及对照人员血清内甘露糖结合凝集素及丝氨酸蛋白酶-2水平,并进行比较分析。结果乳头状癌组血清内甘露糖结合凝集素及丝氨酸蛋白酶-2水平均高于腺癌组及对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),且腺癌组甘露糖结合凝集素及丝氨酸蛋白酶-2水平与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论甲状腺乳头状癌患者血清内甘露糖结合凝集素及丝氨酸蛋白酶-2水平较高,说明两种物质与甲状腺肿瘤的发生有关,作为免疫因子,对肿瘤抵抗起到一定作用。

人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2C端基因的克隆与鉴定

目的:获得人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2(MASP-2)C端编码基因,并表达人MASP-2C端片段,为制备单克隆抗体及应用于临床相关疾病的检测奠定分子学基础。方法:采用RT-PCR技术从人胎肝组织总RNA中扩增人MASP-2C端的cDNA,克隆入pGEX-6p-2表达载体,酶切图谱分析和序列分析鉴定。结果:获得编码人MASP-2C端片段的cDNA,并且与pGEX-6p-2载体连接,转化大肠杆菌XL1-blue,成功构建人MASP-2C端片段cDNA的重组克隆。重组质粒酶切图谱分析和DNA测序分析,人MASP-2C端片段cDNA的重组克隆与GenBank中人MASP-2C端的cDNA序列一致。结论:成功克隆了人MASP-2C端片段cDNA,并在大肠杆菌中表达人MASP-2C端多肽片段。

鲤肌肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的分子克隆(英文)

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)是最近发现的一种蛋白酶。该酶参与肌原纤维蛋白的降解及鱼糜制品弹性的下降。但是,对该酶一级结构的研究,迄今为止,未有报道。本文根据已测定的鲤MBSP N-末端氨基酸序列以及丝氨酸蛋白酶活性中心保守序列设计兼并引物,结合RT-PCR技术实现了MBSP基因片段的扩增。再根据克隆到的MBSP片段序列设计基因特异引物,用于MBSP基因的5′和3′末端快速扩增。综合以上结果,鲤MBSP的全长被确定。序列分析表明,MBSP cDNA含有一732 bp的开放阅读框,编码243个氨基酸残基,其中信号肽长度为21个氨基酸残基。组成丝氨酸蛋白酶活性中心的氨基酸残基(His61,Asp107和Ser197)在MBSP中保守存在。成熟MBSP含有222个氨基酸残基,分子量为24.5 ku,比其天然蛋白的分子量30 ku略小。成熟MBSP的等电点为10.43。鲤MBSP与鲫MBSP,猪胰蛋白酶,牛胰蛋白酶,美洲鲽胰蛋白酶的同源性分别为80.6%,55.8%,55.3%和53.9%。而与仓鼠肌肉中具有胰凝乳蛋白酶性质的蛋白酶的同源性为39.2%。MBSP有高含量的赖氨酸残基(11.93%),此特性可能与该酶的肌原纤维结合特性有关。

鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶研究进展

本文综述鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)的分离纯化、酶学特性、分子生物学及基因重组表达等方面的研究进展。鱼类MBSP是一种弱碱性蛋白酶,它普遍存在于鱼类肌肉中。MBSP降解肌原纤维蛋白是造成鱼糜凝胶劣化的主要原因。同时,由于鱼类MBSP具有良好的热稳定性及对精氨酸或赖氨酸残基羧基端特异分解的底物特异性,因此,该蛋白酶有望开发成为一种新颖的工具酶应用于蛋白质质谱鉴定等研究领域。

2型糖尿病患者血清脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂与糖脂代谢的相关性研究

目的探讨2型糖尿病患者血清中脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)与糖脂代谢的关系。方法用ELISA法测定80例2型糖尿病,69例空腹糖耐量受损患者,73例健康对照者血清中vaspin的水平,同时测定空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、空腹胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(HBA1C)、超敏CRP(hsCRP),并做统计学处理。结果 2型糖尿病组vaspin水平显著高于健康对照组和空腹糖耐量受损组(P<0.05),空腹糖耐量受损组vaspin水平高于健康对照组(P<0.05)。同组患者中肥胖亚组vaspin水平高于非肥胖亚组(P<0.05),2型糖尿病组中血清vaspin与体质指数(body mas index,BMI)、FBG、FINS、HOMA-IR、TG、hsCRP呈正相关(r值分别为0.472、0.464、0.302、0.347、0.268、0.311,P<0.05)。结论 Vaspin是联系2型糖尿病糖脂代谢的重要脂肪因子,与BMI、FBG、FINS、HOMA-IR、TG、hsCRP呈正相关,可为2型糖尿病治疗提供新思路。

藤芪通络颗粒治疗2型糖尿病下肢血管病变气虚血瘀证患者的疗效及对血清丝氨酸蛋白酶抑制剂、视黄醇结合蛋白4水平的影响

目的探讨藤芪通络颗粒治疗2型糖尿病下肢血管病变气虚血瘀证患者的疗效及对血清丝氨酸蛋白酶抑制剂、视黄醇结合蛋白4水平的影响。方法选取2018年3月—2020年3月期间青岛市立医院本部内分泌科诊治的2型糖尿病下肢血管病变患者82例,采用随机数字表法分为治疗组和对照组,每组各41例。对照组患者给予基础干预措施,治疗组患者在对照组基础上给予藤芪通络颗粒治疗。两组患者均持续治疗12周后,观察比较两组患者临床疗效,治疗前后血糖、血清腹内脂肪型丝氨酸蛋白酶抑制剂(Visceral adipose-specific serine protease inhibitor,Vaspin)、血清视黄醇结合蛋白4(Retinol binding protein 4,RBP4)、中医证候积分、踝肱指数及足背动脉血流量。结果两组患者治疗后空腹血糖、餐后2 h血糖水平均较治疗前降低,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗组空腹血糖、餐后2 h血糖水平均较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后治疗组临床总有效率为87.80%(36/41)明显高于对照组68.29%(28/41),差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者治疗后血清Vaspin水平均较治疗前升高,RBP4水平均较治疗前降低,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗组血清Vaspin水平较对照组明显升高,RBP4水平较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者治疗后中医证候面色晦暗、肌肤甲错、自汗、气短懒言、倦怠乏力、肢体疼痛、肢体麻木积分均较治疗前降低,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗组均较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者治疗后踝肱指数、足背动脉血流量均较治疗前升高,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗组较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论2型糖尿病下肢血管病变气虚血瘀患者,采用藤芪通络颗粒进行治疗,可提升治疗效果,降低血糖以及血清RBP4水平,提高血清Vaspin水平,改善患者临床症状,提升踝肱指数以及足背动脉血流量。

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽的筛选和鉴定

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶在病毒复制和包装中的重要作用使其成为特异性抗病毒药物研究的首选靶标。根据丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,用柔性连接子连接NS3丝氨酸蛋白酶结构域和NS4A的核心序列 ,构建成单链丝氨酸蛋白酶基因并且在大肠杆菌中获得高水平的可溶性表达 ,纯化后的目的蛋白能够切割重组蛋白底物NS5ab。随后 ,以单链丝氨酸蛋白酶为靶分子对噬菌体展示的随机十二肽库进行了三轮淘筛 ,挑选的 44个克隆中有 3 7个克隆能够特异性地结合丝氨酸蛋白酶 ,并且这种结合作用为竞争性ELISA试验结果所支持。对 1 3个克隆进行序列测定 ,得到 6种序列 ,它们在氨基酸组成上存在明显偏性 ,富含组氨酸和色氨酸 ,缺乏酸性氨基酸 ;

妊娠期糖尿病患者血清内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂视黄醇结合蛋白4水平及与糖脂代谢的相关性

妊娠期糖尿病(GDM)为在妊娠期发生的糖代谢异常性疾病,研究发现,GDM的发生不仅可明显增加不良母婴结局的发生风险,还可对子代远期发育产生不利影响[1]。GDM的发生机制目前尚未明确,多认为与胰岛素抵抗(IR)相关,研究发现,脂肪因子可通过对机体IR的影响,参与至GDM的发展过程中,近年来已成为GDM发生机制的研究热点[2]。其中内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)、视黄醇结合蛋白4(RBP4)均为脂肪相关因子,可通过影响机体对胰岛素(INS)的敏感性,促进GDM的发生和发展[3]。