不同诱导物对白地霉中高级醇脱氢酶的影响

化学或物理因子作为诱导物,能够直接或间接影响菌体基因转录表达。为探索高级醇底物对白地霉的诱导效果,以分离自土壤的白地霉S12为对象,采用五种高级醇(正丙醇、正丁醇、异丁醇、正己醇和异戊醇)作为诱导物,研究不同高级醇的诱导剂量、诱导时间对菌体S12降解不同高级醇活性及脱氢酶活力的影响。结果表明,当正己醇和异丁醇分别作为诱导剂时,胞内酶活力较高。正丙醇、正丁醇、异丁醇和正己醇作为诱导剂时,最适诱导时间均为6 h;而以异戊醇为诱导剂时,最佳诱导时间为12 h。以正丙醇和正己醇为诱导剂时,最适的诱导浓度为1.5 g/L;以正丁醇、异丁醇和异戊醇为诱导剂时,最适诱导浓度分别为1.0、0.5和2.5 g/L。NativePAGE电泳结果表明,以五种高级醇为诱导剂均能使菌体合成分子量为223 kDa左右的脱氢酶。其中,以正己醇为诱导剂时所得菌体同时降解多种高级醇的能力最强,其降解产物均为其相应的酸类和酯类物质。

玉米大斑病菌醇脱氢酶基因家族的鉴定和生物信息学分析

醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)是生物体内主要短链醇代谢的关键酶,在物质代谢和能量转化过程中发挥着重要作用。本文从玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)基因组的KEGG数据库中获得了22个ADH基因家族成员(StADH1-StADH 22),它们散布在12条scaffold上,长232~495 aa,理论等电点5.65~9.22,81.8%家族成员呈酸性,72.7%为亲水蛋白,有4个家族成员定位于线粒体,2个定位于过氧化物酶体,其余16个家族成员均定位于细胞质。系统发育分析结果表明,有11个玉米大斑病菌ADH家族蛋白与酵母ADH(YADH1-7)亲缘关系较近,含有相似的保守基序和结构域,其他11个玉米大斑病菌ADH家族蛋白与酵母ADH亲缘关系较远,含有不同的保守基序和结构域。玉米大斑病菌侵染玉米叶片的转录组分析结果表明,仅有4个ADH基因(StADH 1、StADH 4、StADH 6和StADH 12)参与病菌侵染过程,其中StADH 1、StADH 4和StADH 12主要在病菌侵染后期发挥作用,而StADH1还可能与病菌的致病专化性有关。

醇脱氢酶的研究进展及其催化增值生物基呋喃化合物前景展望

醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)广泛存在于生物体内,可应用于多种有机物选择性氧化还原。近年来,随着对酶的催化机理、结构认知、分子改造和反应系统构建及强化等方面研究的逐渐深入,ADH在生物基平台化合物的高选择性催化氧化还原方面展现出巨大潜力。本文综述了ADH分子设计和定向改造的前沿技术和进展,面向常见的辅因子依赖性ADH催化过程中的辅因子高成本及稳定性差等局限,聚焦酶反应过程中的辅因子再生强化技术,梳理了适用于ADH催化系统的化学驱动、酶驱动和光电驱动辅因子再生路径,并从单酶催化体系开发、多酶协同催化系统挖掘、全细胞催化技术发展与应用等多个角度概述了ADH在催化生物基呋喃化合物方向的最新研究进展。随着对ADH应用潜力的进一步挖掘,未来ADH有望成为生物基呋喃增值工业化进程中的重要组成部分,为能源生产的绿色发展提供助力。

1-磷酸甘露醇脱氢酶基因转化水稻的研究

PCR和 Southern blotting检测表明 ,来自大肠杆菌的 mtl D基因已通过农杆菌介导整合进水稻基因组。mtl D基因在 T1代出现分离 ,T2 代出现纯系。在 0 .75% Na Cl胁迫下 ,7个转基因 T3 代株系都能检测到 mtl D酶活性 ,与对照相比细胞膜的相对电导率和大分子渗漏值明显降低。部分转基因株系能在 1 .0 % Na Cl浓度下正常生长 ,而对照在 0 .5% Na Cl浓度下已不能存活。通过有性杂交途径实现了 mtl D和 gut D两个基因的聚合 ,部分杂交后代株系能在 1 .2 5% Na Cl胁迫下正常生长结实。

假单胞菌(Pseudomonas sp. cn 4902)甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及表达

参照几种生物的甘露醇 1 磷酸脱氢酶基因 (mtlD)的序列设计引物 ,以极端耐盐的假单胞菌 (Pseudomonassp cn 4 90 2 )的总DNA为模板 ,采用PCR扩增、构建重组高效表达载体以及生物信息学研究等方法 ,进行基因克隆、表达及功能定性等研究。结果表明 ,克隆获得一长为 114 9bp的基因。经蛋白质保守区域研究 ,初步判别该基因为mtlD结构基因。将该基因与pBV2 2 0质粒构建成高效表达原核重组载体pBH。SDS PAGE电泳表明 ,含pBH的转化子产生特异的、分子量约为 4 1kD的蛋白带 ,表达量约占菌体可溶性蛋白 6 7%。转化子的耐盐水平比对照提高了约 1/5。在含 0 9mol/LNaCl的液体培养基中 ,转化子培养 2 4h后其生物量约是对照的 10 2倍 ,甘露醇含量约是对照的 4 1倍。可见 ,假单胞菌的甘露醇 1 磷酸脱氢酶基因是一个重要的耐盐相关基因 ,该基因已在GenBank登记 ,代号为AY112 6 96。

乳酸细菌甘露醇脱氢酶研究进展

由于在医药、食品、化工行业中的需求不断增长,甘露醇的生产制备受到国内外的重视。乳酸细菌生产甘露醇具有反应选择性高、反应条件温和,甘露醇收率高等优点,是甘露醇生产研究的热点。乳酸细菌甘露醇脱氢酶是异型发酵乳酸细菌合成甘露醇的关键酶。本文综述了乳酸细菌甘露醇脱氢酶的研究概况,包括酶学特性、结构及分子生物学,并对其研究前景进行了展望。

大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达

以大肠杆菌(Escherichia coli)W3350菌株总DNA为模板,根据已报道的几种生物的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase)基因(mtlD)序列设计引物,通过PCR扩增到1条长约1.15 kb的特异片断,把该片断连接到pUCm-T载体上进行测序。序列分析结果表明,该基因编码区全长1149 bp,共编码382个氨基酸,与报道的mtlD基因修正序列完全一致。将该基因插入到原核表达载体pET28a(+),IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,发现在约45 kD处明显比对照多出1条带,凝胶扫描后经Bandscan 5.0软件分析表明,该特异条带的蛋白含量占菌体可溶性总蛋白的72.9%。Western blot检测其为带组氨酸标签的融合蛋白,而质谱分析证实其为甘露醇-1-磷酸脱氢酶。转化子的耐盐能力比对照提高了约20%。该基因提交到GeneBank数据库,返回的接受号为DQ660889。

大肠杆菌Top10甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及生物信息学分析

根据细菌中存在的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase,mtlD)的基因序列,采用PCR扩增的方法从大肠杆菌(Escherichia coli)Top10中克隆到了mtlD基因(Acession numeber:EU433565)。mtlD开放阅读框为1149bp,编码含有382个氨基酸残基,分子量为41.2kD的蛋白,预测等电点为5.37。mtlD含有38个碱性氨基酸,50个酸性氨基酸,158个疏水氨基酸及72个极性氨基酸。二级结构预测表明该蛋白含约60.47%的α-螺旋、4.71%的β-转角、10.73%的延伸链和20.48%的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,mtlD是亲水性蛋白。亚细胞定位分析表明mtlD主要定位于细胞质中。序列分析表明大肠杆菌Top10mtlD基因与大肠杆菌W3350、大肠杆菌DEC12a和盐生盐杆菌(Halobacterium salinarum)的mtlD基因同源性分别为99%、97%和93%。大肠杆菌Top10mtlD基因的克隆及生物信息学分析为今后对mtlD的进一步深入研究奠定了基础。

基于醇脱氢酶催化-动力学荧光分析法测定食品中乙醇的含量

醇脱氢酶(ADH)是生物体内重要的氧化还原催化剂之一,很多醇类代谢都通过醇脱氢酶催化完成。基于以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和乙醇为底物,在醇脱氢酶作用下催化转化为无荧光的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和乙醛,联合动力学荧光分析法测定食品基质中的乙醇含量。通过三因素四水平正交实验,考察得到最佳反应体系为20μL脱氢酶溶液(31600 U·L^(-1)),40μL NAD溶液(0.05 mol·L^(-1))和pH值8.4的Tris-HCl缓冲溶液(0.05 mol·L^(-1))。根据以上体系中还原型NAD(NADH)荧光值的变化计算酶促反应速度,结合米氏方程测定乙醇含量。金属离子、蛋白质、抗坏血酸等添加剂的干扰实验表明,酶对催化反应具有较高专一性,可以通过EDTA等有效避免,该方法在1.0~5.0 mmol·L^(-1)有较好的线性,加标回收实验回收率在96%~104%。该方法具有较高灵敏,较低检测限,能准确测定生物样品和食品样品中乙醇的含量。

假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶基因的克隆及表达

利用聚合酶链式反应从假肠膜明串珠菌中扩增出甘露醇脱氢酶(mannitol dehydrogenase,MDA)基因的结构基因,克隆入表达载体p ETDuet-1,构建了甘露醇脱氢酶表达质粒p ETDuet-1-mdh,将其转化进入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶结构基因长度为1 017 bp,重组甘露醇脱氢酶基因在大肠杆菌内成功表达,其蛋白质分子质量为36.0 k D;重组甘露醇脱氢酶活力为0.15 U/mg pro,高于假肠膜明串珠菌中甘露醇脱氢酶活力0.03 U/mg pro。

NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的重组表达及甘露醇的转化条件

对NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的异源表达和对果糖的转化情况进行分析,为在细胞内构建甘露醇的合成途径奠定基础。构建重组菌株BL21(DE3)/p ET28a-mdh,对其进行诱导发酵后,通过His标签对目的蛋白进行纯化,并利用HPLC分析纯化后的甘露醇脱氢酶转化果糖生成甘露醇的情况。成功构建了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶重组表达菌株BL21(DE3)/p ET28amdh,并对表达后的甘露醇脱氢酶进行了纯化,测得纯化后的甘露醇脱氢酶酶活力为270 U/m L。对酶法转化果糖得到甘露醇的转化条件进行优化,确定最佳的转化条件为:当底物浓度为300 g/L,反应初始p H5.8,温度40℃,NADPH终浓度为9 mmol/L时,甘露醇转化率可以达到97.4%。实现了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶在大肠杆菌中的活性表达,为进一步研究大肠杆菌合成甘露醇的代谢调控提供了依据。

来源于P.bacterium 1109的甘露醇脱氢酶的重组纯化及酶学性质研究

本文将来自P.bacterium 1109的甘露糖醇脱氢酶(MDH)表达并提取纯化,研究了该重组酶的酶学性质及其在甘露醇生产中的工艺条件。结果显示重组MDH是一个相对分子量为37 kDa的四聚体。氨基酸序列比对发现其与大多数MDHs的同源性小于40%。该酶的最适pH和温度分别为8.5和80℃,且当金属离子Zn^(2+)存在时,重组MDH的活力提高到对照组的260%。此外,重组MDH在75℃孵育6 h后仍可保留超过85%的残留活性,热稳定性较高,比大多数MDHs的活性高。底物特异性研究表明其对D-果糖具有较高的专一性。重组MDH催化D-果糖的米氏常数(K_m)和催化效率(k_(cat)/K_m)分别为20 mmol/L和7.5 L/(mmol·min)。重组MDH在以400 mmol/L的D-果糖为底物的反应系统中,可将80%以上的D-果糖转化为甘露糖醇。通过对反应条件的优化,为后续工业化生产制备甘露醇奠定了基础。

乙醛脱氢酶基因敲除对明串珠菌产甘露醇的影响

为了提高甘露醇产量,研究了乙醛脱氢酶基因敲除对明串珠菌碳代谢的影响。利用四环素抗性基因构建了携带抗性标记的同源重组载体;将携带抗性标记的同源重组载体酶切产生无抗性标记的同源重组载体;经过两次同源重组获得了乙醛脱氢酶基因敲除菌株即突变菌株。三基因敲除的突变菌株LeuΔdtsΔldhΔaldh甘露醇产量(9.35 g/L)比原始菌株(7.87 g/L)提高18.8%,乙醇含量产量下降了62%。

球孢白僵菌甘露醇1-磷酸脱氢酶cDNA克隆及生物信息学分析

本研究利用RT-PCR技术克隆获得了球孢白僵菌(Beauveria bassiana)甘露醇1-磷酸脱氢酶(Bb MPD)基因的cDNA序列,并对其氨基酸序列进行生物信息学分析,明确其蛋白典型特征。结果显示,Bb MPD基因cDNA序列长1 176 bp,编码391个氨基酸,分子量约为42.9 k D,理论等电点为5.09;不具有信号肽,属于非分泌蛋白;无跨膜结构,是亲水性蛋白;亚细胞定位预测显示Bb MPD蛋白主要位于细胞质;具有典型的甘露醇1-磷酸脱氢酶保守结构域;α螺旋和无规则卷曲是Bb MPD蛋白主要的二级结构。该结果为进一步研究Bb MPD基因及其功能奠定了基础。

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD6的克隆及正义、反义与RNAi干扰载体的构建

肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步反应,将肉桂醛还原生成相应的肉桂醇。采用PCR方法从棉花中克隆了GhCAD6基因1569 bp的基因组序列,序列分析表明GhCAD6基因由5个外显子和4个内含子组成。为了研究GhCAD6基因的功能,构建由棉纤维组织特异性启动子E6驱动的GhCAD6基因正义、反义表达载体;同时克隆了GhCAD6基因的一段417 bp高度保守的NBD区序列,构建了GhCAD6基因的RNAi干扰载体,并将上述载体转入农杆菌菌株LBA4404中。为通过转基因技术深入研究GhCAD6基因在棉纤维发育和木质素代谢途径中的作用创造条件。

植物肉桂醇脱氢酶及其基因研究进展

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)作为植物次生代谢特别是木质素合成的关键酶,与植物生长发育和抵御病原菌入侵关系密切,研究CAD基因表达调控及其与组织木质化的关系具有重要的植物生理学意义.该文综述了植物CAD的蛋白特征、酶学性质、基因分布和分类、基因结构和表达调控以及CAD表达与木质素合成的关系,为研究CAD在植物生长发育和抗病中的作用提供理论指导.

丹参肉桂醇脱氢酶基因(SmCAD)的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)依赖于NADPH还原肉桂醛及其衍生物,是催化木质素单体生物合成途径的最后一步关键酶。通过分析丹参转录组数据库,从丹参中获得一条肉桂醇脱氢酶基因,命名为SmCAD(Genebank注册号:HQ162287)。该序列包含一个长为1083 bp的开放阅读框,有3个内含子和4个外显子,编码360个氨基酸,含有NADP(H)结合域,Zn1和Zn2锌结合位点。利用BD walking的方法获得其启动子序列1202 bp,序列分析结果表明,SmCAD启动子区包含茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)响应元件以及MYB结合位点。利用实时荧光定量PCR分析表明,该基因在丹参根、茎、叶中均有表达,且其表达受到MeJA的诱导和GA3的抑制,推测该基因可能参与了丹参对外源信号的应答反应。研究结果可为进一步研究SmCAD基因在丹参中的具体功能提供理论依据。

麦红吸浆虫滞育期间海藻糖酶和山梨醇脱氢酶活性的变化

对不同滞育阶段麦红吸浆虫海藻糖酶和山梨醇脱氢酶的活性进行了测定。结果表明，麦红吸浆虫落土滞育前，其幼虫的海藻糖酶活性最高，入土后其活性迅速下降，到9月中旬活性开始上升，随后呈下降趋势，之后又迅速升高至滞育年周期中的最高水平；不同滞育阶段麦红吸浆虫从脱离麦穗到当年11月以前，一直未检测到山梨醇脱氢酶活性，翌年2～4月，山梨醇脱氢酶的活性急剧增加，至04—20达到整个滞育期间的最高值（0．5042OD／（mL·min））；相同滞育阶段，裸露幼虫海藻糖酶活性和山梨醇脱氢酶活性较结茧幼虫略高，并表现出相同的变化趋势；不同滞育年限麦红吸浆虫海藻糖酶活性和山梨醇脱氢酶活性无明显差异。

苹果山梨醇脱氢酶基因家族的克隆及表达分析

【目的】进一步探明苹果中山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH;EC 1.1.1.14)基因家族的分子特性。【方法】从‘嘎拉’苹果中克隆SDH基因家族全长cDNA序列和gDNA序列,检测它们在叶片和果实不同生长时期的表达模式。【结果】获得了12个苹果SDH基因家族cDNA序列,依次命名为MdSDH7—MdSDH18。除MdSDH18基因的全长gDNA序列由6个外显子和5个内含子组成,其余基因的全长gDNA序列由2个外显子和1个内含子组成。根据氨基酸序列相似性可以将这些SDH基因分为A和B两类。所有SDH基因在果实不同生长期均有表达,且中后期表达高于初期,但果实初期的SDH活性高于中后期。A类SDH基因在叶片不同生长时期的表达水平为幼叶>衰老叶>成熟叶,SDH活性也呈现出同样的趋势,但B类SDH基因在叶片不同生长时期的表达水平为衰老叶>成熟叶>幼叶。【结论】进一步证明了SDH基因在苹果中是以基因家族的形式存在的,且不同的基因家族成员在叶片和果实中有不同的表达特性。