大肠杆菌Top10甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及生物信息学分析

根据细菌中存在的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase,mtlD)的基因序列,采用PCR扩增的方法从大肠杆菌(Escherichia coli)Top10中克隆到了mtlD基因(Acession numeber:EU433565)。mtlD开放阅读框为1149bp,编码含有382个氨基酸残基,分子量为41.2kD的蛋白,预测等电点为5.37。mtlD含有38个碱性氨基酸,50个酸性氨基酸,158个疏水氨基酸及72个极性氨基酸。二级结构预测表明该蛋白含约60.47%的α-螺旋、4.71%的β-转角、10.73%的延伸链和20.48%的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,mtlD是亲水性蛋白。亚细胞定位分析表明mtlD主要定位于细胞质中。序列分析表明大肠杆菌Top10mtlD基因与大肠杆菌W3350、大肠杆菌DEC12a和盐生盐杆菌(Halobacterium salinarum)的mtlD基因同源性分别为99%、97%和93%。大肠杆菌Top10mtlD基因的克隆及生物信息学分析为今后对mtlD的进一步深入研究奠定了基础。

假单胞菌(Pseudomonas sp. cn 4902)甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及表达

参照几种生物的甘露醇 1 磷酸脱氢酶基因 (mtlD)的序列设计引物 ,以极端耐盐的假单胞菌 (Pseudomonassp cn 4 90 2 )的总DNA为模板 ,采用PCR扩增、构建重组高效表达载体以及生物信息学研究等方法 ,进行基因克隆、表达及功能定性等研究。结果表明 ,克隆获得一长为 114 9bp的基因。经蛋白质保守区域研究 ,初步判别该基因为mtlD结构基因。将该基因与pBV2 2 0质粒构建成高效表达原核重组载体pBH。SDS PAGE电泳表明 ,含pBH的转化子产生特异的、分子量约为 4 1kD的蛋白带 ,表达量约占菌体可溶性蛋白 6 7%。转化子的耐盐水平比对照提高了约 1/5。在含 0 9mol/LNaCl的液体培养基中 ,转化子培养 2 4h后其生物量约是对照的 10 2倍 ,甘露醇含量约是对照的 4 1倍。可见 ,假单胞菌的甘露醇 1 磷酸脱氢酶基因是一个重要的耐盐相关基因 ,该基因已在GenBank登记 ,代号为AY112 6 96。

大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达

以大肠杆菌(Escherichia coli)W3350菌株总DNA为模板,根据已报道的几种生物的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase)基因(mtlD)序列设计引物,通过PCR扩增到1条长约1.15 kb的特异片断,把该片断连接到pUCm-T载体上进行测序。序列分析结果表明,该基因编码区全长1149 bp,共编码382个氨基酸,与报道的mtlD基因修正序列完全一致。将该基因插入到原核表达载体pET28a(+),IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,发现在约45 kD处明显比对照多出1条带,凝胶扫描后经Bandscan 5.0软件分析表明,该特异条带的蛋白含量占菌体可溶性总蛋白的72.9%。Western blot检测其为带组氨酸标签的融合蛋白,而质谱分析证实其为甘露醇-1-磷酸脱氢酶。转化子的耐盐能力比对照提高了约20%。该基因提交到GeneBank数据库,返回的接受号为DQ660889。

1-磷酸甘露醇脱氢酶基因转化水稻的研究

PCR和 Southern blotting检测表明 ,来自大肠杆菌的 mtl D基因已通过农杆菌介导整合进水稻基因组。mtl D基因在 T1代出现分离 ,T2 代出现纯系。在 0 .75% Na Cl胁迫下 ,7个转基因 T3 代株系都能检测到 mtl D酶活性 ,与对照相比细胞膜的相对电导率和大分子渗漏值明显降低。部分转基因株系能在 1 .0 % Na Cl浓度下正常生长 ,而对照在 0 .5% Na Cl浓度下已不能存活。通过有性杂交途径实现了 mtl D和 gut D两个基因的聚合 ,部分杂交后代株系能在 1 .2 5% Na Cl胁迫下正常生长结实。

霍乱弧菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD的克隆表达

目的克隆表达霍乱弧菌甘露醇特异性磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统操纵子中的甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因mtlD。方法以测序株N16961染色体为模板,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增mtlD基因,扩增产物经NdeⅠ和XhoⅠ酶切后克隆入表达载体pET-30a。0.1 mmol/L IPTG诱导表达,超声裂解上清经Ni柱亲和层析纯化,比色法测定酶活性。结果 mtlD基因成功克隆入表达载体pET-30a,在宿主菌BL21中诱导表达,利用Ni亲和层析柱获得较高纯度的羧基端带His标签的MtlD蛋白,并具有酶活性。结论表达纯化了有活性的霍乱弧菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶,为进一步的功能研究打下了基础。

共转染小干扰RNA质粒联合抑制HeLa细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和转酮醇酶样基因-1表达

目的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)及转酮醇酶样基因-1(transketolase like-1,TKTL-1)是肿瘤细胞磷酸戊糖代谢途径(pentose phosphate pathway,PPP)的2个重要关键调节酶。拟通过共转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体同时沉默人宫颈癌Hela G6PD及TKTL-1后,观察其对G6PD和TKTL1的联合抑制作用,旨在探讨共转染siRNA表达载体联合抑制PPP的效果及可行性。方法分别构建靶向G6PD和TKTL1基因siRNA干扰质粒载体,通过酶切和测序鉴定siRNA干扰质粒载体构建成功后,单独或共转染HeLa细胞株,RT-PCR检测G6PD、TKTL1 mRNA表达并结合G6PD、转酮醇酶(transketolase,TKT)活性测定判断并比较共转染联合抑制Hela细胞G6PD、TKTL1表达的效果。结果共转染靶向G6PD和TKTL1基因的siRNA干扰载体能显著下调G6PD和TKTL1基因表达水平[(0.96±0.05)vs(0.47±0.04),(0.98±0.05)vs(0.41±0.04),P<0.01]。同时,2个酶的活性也显著下降(99.2%vs34.5%和99.8%vs 40.1%,P<0.01)。共转染抑制G6PD基因mRNA表达较单独转染靶向G6PD基因的siRNA干扰载体的效果有显著下降[(0.47±0.04)vs(0.31±0.04),P<0.01)]。结论共转染siRNA干扰载体对人宫颈癌HeLa细胞PPP代谢通路进行联合抑制是一种有效的实验方案。

6-磷酸山梨醇脱氢酶基因转化水稻(Oryza sativa L.)研究

以水稻品种秀水 1 1的幼胚为外植体 ,对影响愈伤组织诱导及植株再生的因素进行了研究 .结果表明 :MS+2 ,4- D 2 mg/L作培养基 ,愈伤组织诱导率达 1 0 0 % ,愈伤组织在 MS+6- BA2 mg/L+NAA 0 .1 mg/L的培养基上 ,分化频率高达 75.3% ;在此基础上利用基因枪转化技术 ,将外源的 6-磷酸山梨醇脱氢酶基因 (gut D)导入水稻基因组 ,转基因植株表现出对 Na Cl较强的耐性 .

球孢白僵菌甘露醇1-磷酸脱氢酶cDNA克隆及生物信息学分析

本研究利用RT-PCR技术克隆获得了球孢白僵菌(Beauveria bassiana)甘露醇1-磷酸脱氢酶(Bb MPD)基因的cDNA序列,并对其氨基酸序列进行生物信息学分析,明确其蛋白典型特征。结果显示,Bb MPD基因cDNA序列长1 176 bp,编码391个氨基酸,分子量约为42.9 k D,理论等电点为5.09;不具有信号肽,属于非分泌蛋白;无跨膜结构,是亲水性蛋白;亚细胞定位预测显示Bb MPD蛋白主要位于细胞质;具有典型的甘露醇1-磷酸脱氢酶保守结构域;α螺旋和无规则卷曲是Bb MPD蛋白主要的二级结构。该结果为进一步研究Bb MPD基因及其功能奠定了基础。

6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutD)基因克隆、测序和表达

本研究根据6 磷酸山梨醇脱氢酶基因(gutD)两端序列设计引物,以假单胞杆菌(PseudonmonasXM)的总DNA为模板通过PCR的方法克隆gutD基因并进行序列分析.将克隆得到的gutD基因与原核表达载体pBV220连接并转化大肠杆菌(Es cherichiacoli)JM101后检测其蛋白表达及菌株生长耐盐性.

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子的转化及其转录活性

【目的】研究6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子(S6PDHp)的组织表达特点。【方法】利用Gateway技术构建了S6PDHp与GUS基因的融合表达载体,然后通过农杆菌介导法转化番茄"中蔬5号",对转基因植株进行PCR检测,对鉴定为阳性的植株进行GUS组织化学染色,验证S6PDHp的组织表达特性。【结果】将S6PDHp-GUS融合表达载体转化番茄,经PCR检测显示,成功获得了转S6PDHp基因的阳性番茄植株。对阳性植株各组织器官的GUS化学染色和活性检测结果显示,除叶片外许多器官都有很强的GUS活性,且在转基因番茄成熟期植株的茎部活性最高,根部活性最低;叶片从新叶到老叶的各个时期,GUS活性持续降低。【结论】S6PDHp表达在植物衰老过程中降低;且在转基因番茄茎部的GUS活性最强,说明该启动子具有组织表达特异性。

干旱胁迫下小麦葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因TaG6PDH1的表达特征及启动子分析

为进一步揭示小麦抗旱性的生物学机理,通过电子克隆和RT-PCR方法,在水源11小麦叶片中分离得到1个新的小麦葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因TaG6PDH1后进行基因序列特征和启动子元件组成分析,并利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术对其在PEG模拟干旱胁迫下的表达特征进行分析。结果表明,TaG6PDH1基因的cDNA全长1 338bp,编码445个氨基酸。TaG6PDH1蛋白具有典型的G6DPH结构,即C-端葡萄糖-6-磷酸结合激活序列、N-端NAD(P)结合位点和C-端保守的Cys位点。系统进化分析表明,TaG6PDH1蛋白与质体型G6PDH中的P2型相似性较高,其与OsG6PDH5有极高的同源性。启动子区域分析表明,所选区域包含核心启动子和上游应答元件,该区域为TaG6PDH1基因转录的启动子区域,在该区域存在的顺式作用元件有ERF1与HMG-I/Y等,在调控植物防卫反应中有重要的生物学意义。qRT-PCR分析表明,TaG6PDH1基因在PEG模拟干旱胁迫下从6h开始被上调,48h被上调最大,说明TaG6PDH1基因参与了小麦干旱应答防卫反应,其可能作为一种正调控因子参与到小麦的防卫反应信号途径中。

siRNA沉默转酮醇酶样蛋白1基因对人肝癌HepG2细胞生长微环境的影响

目的:通过siRNA技术沉默肝癌细胞系HepG2转酮醇酶样蛋白1(TKTL1)基因后观察其对生长微环境中乳酸生成水平、还原型谷胱甘肽(GSH)水平及NADPH/NADP+比值的影响,旨在探讨肿瘤细胞TKTL1表达与其转移特性的内在联系。方法:用构建的靶向TKTL1基因siRNA干扰质粒载体转染HepG2细胞株,RT-PCR检测TKTL1 mRNA表达并结合转酮醇酶(TKT)活性测定判断其干扰效率;以未转染HepG2细胞为对照,进一步观察TKTL1沉默的癌细胞内乳酸生成水平、GSH含量、NADPH/NADP+比值及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)活性的变化。结果:siRNA沉默HepG2细胞TKTL1基因后TKTL1 mRNA表达下降、TKT活性显著降低(P<0.01),乳酸生成、GSH水平及NADPH/NADP+比值较对照组细胞均显著降低(P<0.01),但G-6-PD活性无明显变化(P>0.05)。结论:肿瘤可能通过TKTL1高表达调整葡萄糖代谢从而改变乳酸及氧化自由基生成,使细胞生长微环境利于肿瘤转移。

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子逆境诱导表达特性研究

为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)基因启动子(S6PDHp)的逆境诱导表达特性,利用Gateway技术构建了S6PDH基因启动子区5'端系列缺失体与GUS基因的融合表达载体,并通过农杆菌介导法转化拟南芥。对转基因拟南芥进行低温和外源ABA处理,通过GUS蛋白活性变化分析S6PDHp的逆境诱导表达特性。研究结果发现,通过Gateway技术构建了4个S6PDHp 5'端系列缺失体与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的融合表达载体(pGWB433-S6PDHp1、pGWB433-S6PDHp2、pGWB433-S6PDHp3和p GWB433-S6PDHp4)并获得了相应的转基因拟南芥。对转基因植株进行低温处理后发现,p GWB433-S6PDHp3转基因植株中的GUS活性增幅最大,达到显著水平,而其他转基因植株中的GUS活性基本保持不变。外源ABA处理后发现,除p GWB433-S6PDHp4外,其余启动子缺失体转基因拟南芥中GUS活性显著升高。以上结果表明,低温和外源ABA能够诱导S6PDHp的表达,但不同的缺失体响应程度不同,意味着在S6PDHp序列(-2 396bp至-236bp)中可能存在着响应逆境胁迫的正负调控顺式作用元件。

辣椒CaDXS和CaPDS基因沉默的表型比较

【目的】沉默辣椒CaDXS和CaPDS基因,比较分析两者白化表型的差异,寻找新的辣椒沉默标记基因。【方法】利用双酶切克隆技术构建CaDXS和CaPDS基因的沉默载体;通过农杆菌介导转化侵染辣椒,观察辣椒的沉默表型;采用实时荧光定量PCR技术检测CaDXS和CaPDS基因的沉默效率。【结果】农杆菌浸润21 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现褪绿症状,沉默CaPDS基因的辣椒叶片出现白化。农杆菌浸润30 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现较为明显的白化;沉默CaPDS基因的辣椒叶片白化程度加剧,新叶近乎白化。与CaDXS基因相比,沉默CaPDS基因导致的辣椒白化表型更明显和高效。沉默组辣椒叶片中CaDXS和CaPDS基因的表达量均显著降低(P<0.05),沉默效率分别为86.80%和93.08%,表明辣椒CaDXS和CaPDS基因被成功沉默。【结论】CaDXS基因可以作为辣椒的沉默标记基因,但沉默CaPDS基因的辣椒白化表型出现更早且明显,因此,CaPDS基因比CaDXS基因更适合作为辣椒沉默标记基因。

种子特异启动子的GPD1基因植物表达载体构建

利用PCR技术从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和酵母INVSc1(Saccharomyces cerevisiae)的基因组DNA中分别扩增获得种子特异启动子napin和3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)基因片段,并将它们分别克隆到pMD18-T载体中。利用中间载体pBluescriptKS将两目的片段插入到植物表达载体pCAMBIA1390的多克隆位点处,构建了种子特异启动子napin驱动的GPD1基因植物表达载体p1390NG,并用冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、EHA105和AGL1中,可应用于油料能源植物种子含油量的遗传改良。

髓锌指基因1对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的研究葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)和髓锌指基因1(MZF-1)在骨肉瘤中的作用及其可能的作用机制。方法实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测MZF-1和G6PD在骨肉瘤细胞中的表达;MTT法检测过表达MZF-1对骨肉瘤细胞增殖的影响;流式细胞仪检测过表达MZF-1对骨肉瘤细胞凋亡及细胞周期的影响;荧光素酶报告基因分析法验证MZF-1与G6PD启动子区的相互作用关系。结果在骨肉瘤细胞中,MZF-1的表达下降,G6PD表达上升。过表达MZF-1可抑制骨肉瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,并且将细胞周期阻滞于G0/G1期。荧光素酶报告基因分析结果表明,MZF-1可靶向结合到G6PD的启动子区域并负向调控G6PD的表达。结论 MZF-1可通过负向调节G6PD的表达,在骨肉瘤的发生、发展过程中发挥抑癌的作用,为骨肉瘤治疗提供新的思路。

以WST-5为色源脱氢酶法测定血清1,5-AG含量

目的:建立以WST-5为色源,脱氢酶法测定血清1,5-AG含量的新方法。方法:用ATP依赖性己糖激酶将1,5-脱水葡萄糖醇和主要干扰物葡萄糖分别转化为1,5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸和葡萄糖-6磷酸,转化后的1,5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸被1,5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶脱氢氧化,同时使水溶性WST-5还原为有色物质,比色定量。结果:该法线性范围为0μmol/L～504μmol/L,平均回收率为99.3%;批内、批间相对标准差(RSD)分别为1.2%～3.3%和2.4%～3.9%;与参考方法相比的回归方程及相关系数分别为Y=1.009X-1.117,r=0.9984。结论:该法具有快速、简便、灵敏可靠等优点,适合临床应用。

在明串珠菌中构建葡萄糖到甘露醇的转化体系

为了进一步提高甘露醇产量,在明串珠菌构建了葡萄糖到甘露醇的转化体系。通过2次同源重组,将mt1d-m1p表达盒串联体定点插入到染色体上。以90g/L蔗糖为底物时,野生型菌株的甘露醇产量为31.48g/L,Δaldh::(mt1d-m1p)为42.63g/L,Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy为43.47g/L,Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::(mt1d-m1p)为45.74g/L,Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)为47.26g/L。增加甘露醇的合成途径是增产的手段之一。

GPD1L基因对口腔鳞癌细胞系生物学表型影响的体外研究

目的通过体外研究明确GPD1L(甘油三磷酸脱氢酶-1类基因)基因对口腔鳞癌细胞系增殖、迁移及侵袭等生物学表型的影响。方法构建GPD1L过表达稳定转染细胞系,采用CCK8生长曲线、细胞划痕实验、重建基底膜侵袭实验和蛋白免疫印迹实验,明确GPD1L过表达前后口腔鳞癌细胞系增殖、迁移、侵袭能力及相关蛋白表达的变化趋势。结果口腔鳞癌细胞系WSU-HN6、Cal27和Tca83在GPD1L基因过表达后4~5天,出现明显增殖抑制及细胞周期S期阻滞。细胞划痕实验和重组基底膜侵袭实验发现,GPD1L基因过表达明显抑制口腔鳞癌细胞系Cal27和Tca83的迁移和侵袭能力。Western blotting实验证实GPD1L在口腔鳞癌细胞系中过表达可上调PHD2表达,并下调HIF-1α和Cyclin A2蛋白表达。结论GPD1L过表达可以抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及细胞周期阻滞,从而影响口腔鳞癌细胞系体外生物学表型。