梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白.

茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析

以茶树叶片为材料,结合同源克隆方法和RACE技术,克隆了1条UFGT基因,命名为CsUFGT。该基因cDNA全长为1526bp,ORF长1380bp,编码459个氨基酸,推测等电点5.96,推测分子量为49.486 kDa。该基因编码的蛋白质与葡萄UFGT(P51094.2)的一致性为59%,相似性为75%,其C-端含有植物UGT家族成员特有PSPG基序。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在茶树根茎叶中均表达,在第4叶表达量最高,根和茎中表达量较低。

刺五加葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达分析

刺五加是中国的珍贵药用植物,UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase,GT)是催化其三萜皂苷类成分生物合成的关键酶。利用RT-PCR和RACE技术,从该植物中分离出全长为1 959bp的GT基因cDNA序列,该基因开放阅读框为1 827bp,编码一个含608个氨基酸的蛋白质,分子量为6.672 3×104ku。生物信息学分析结果显示,该蛋白包含GT家族的标志性序列,不存在跨膜区域,定位于细胞质中,属于参与植物次生代谢的GT-B型。表达分析的结果表明,刺五加GT基因在各生长时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。最大表达量出现在盛花期,为最低表达量(叶片衰老期)的1.81倍。各器官中,叶片的表达量最高,是最低量幼茎的1.64倍。

甜叶菊葡糖基转移酶基因UGT76G2的克隆及生物信息学分析

本研究利用RT-PCR方法从甜叶菊(Stevia rebaudian)叶片中分离了与甜叶菊UGT76G1高度同源的UGT76G2基因,该基因编码一条分子量为52.029kD的由458个氨基酸残基组成的多肽,含有C-端所特有的高度保守的信号序列PSPG基序和N-端膜结合序列,属于植物中特有PSPG基序的UGT家族成员。半定量RT-PCR分析表明:UGT76G2在甜叶菊根、茎、叶、花不同组织中具有组织表达特异性,在叶组织中的表达丰度略高,在根中不表达而在茎中表达较低。推断的UGT76G2编码产物与其它参与植物次级代谢产物的糖基转移相关酶同源比对和系统发生分析表明该蛋白与康乃馨(Dianthus caryophyllus)DicGT4、棉花(Gossypi-um hirsutum)GhUGT1、甜叶菊(Stevia rebaudian)UGT76H1及玉米(Zea mays)BX8的一致性较高,分别为41%、35%、35%和32%。对UGT76G2和UGT76G1的次级结构和立体结构分析发现,苜蓿(Medicago sativa)UGT71G1与二者的一致性皆为23%,它们有类似的次级结构。在C-端的PSPG信号区内具有10个相同的基质结合位点。但在UGT76G2和UGT76G1之间也有个别位置氨基酸存在差异。它们的N-端含有保守的组氨酸H25和天冬氨酸D124残基,可能与受体的结合有关。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶基因多态性的研究进展

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)是生物体内进行第Ⅱ相生物转化时最重要的一种酶。UGT广泛分布于人体的肝、肾和肠等不同组织,代谢大量的外源性毒性物质和内源性物质。研究发现,UGT1A基因多态性是个体间葡萄糖醛酸化活性差异的重要原因之一。本文就UGT1A基因多态性的研究现状予以综述。

滇牡丹类黄酮7-O-葡萄糖基转移酶基因的鉴定与表达分析

以野生滇牡丹为试验材料,以其转录组数据为基础,采用反转录PCR技术克隆得到一个具完整开放阅读框的类黄酮7-O-葡萄糖基转移酶基因(Pd7GT),并通过生物信息学分析手段、基因表达对该基因进行分析。结果显示:该基因全长1 446bp (Gen Bank登录号为KX394687),可编码481个蛋白氨基酸;生物信息学分析发现Pd7GT蛋白C末端含有典型糖基转移酶识别区(WAPQV)和UDP-葡萄糖基配体绑定位点(HCGWNS)的PSPG盒子,其蛋白序列GWAPQVMILEHEAVGGFVTHCGWNSTLEGISAGLPLVTWPIFAEQFYNEK,与可可(XP_007042481)、Herrannia umbratica (XP_021298085)、毛果杨(XP_006379195)、巨桉(XP_010066837)等以葡萄糖为糖基配体的类黄酮7-O-糖基转移酶聚为一类; Pd7GT基因在组织茎中表达量最高、不同花发育时期的花谢期表达量最高、不同颜色花瓣中黄花花瓣表达量最高。本研究为滇牡丹糖基转移酶异源表达、分子育种等研究提供一定的基础,为未来通过基因工程培育具新颖花色和抗性的滇牡丹新品种提供必要材料。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶基因突变的研究现状

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)基因突变可引起先天性高非结合胆红素血症。现就UGT基因突变研究现状进行综述,包括UGT基因的定位及结构,UGT突变与Crigler-Najjar综合征Ⅰ(CNⅠ)、Crigler-Najjar综合征Ⅱ(CNⅡ)和Gilbert综合征(GS)以及UGT基因治疗研究进展等。UGT基因突变研究,将有助于先天性高非结合胆红素血症的临床诊断和治疗。

橘核柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因(lgt)的克隆与表达分析

目的:从橘核主要来源品种大红袍Citrus reticulata‘Dahongpao’的总RNA中克隆获得柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因(lgt),并对其进行生物信息学相关表达分析。方法:提取橘核总RNA,克隆获得了lgt基因序列,通过生物信息学对其蛋白的特征进行分析,构建lgt与其相关物种lgt的系统进化树,利用RT-PCR分析橘核不同时期的lgt基因表达量,并进行分析。结果:克隆获得lgt基因的总长度为1 372 bp,编码457个氨基酸,利用生物信息学分析其属于糖基转移酶超家族的亲水性蛋白,有较多的α-螺旋和自由卷曲,存在于真核生物细胞质,通过RT-PCR分析种子在脱水干燥时期表达量最低,其次为形态建成时期,成熟时期表达量最高。结论:首次从大红袍中成功克隆lgt基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制奠定了基础。

变形链球菌葡萄糖基转移酶基因部分DNA克隆

根据变链菌ｇｔｆＢ基因序列设计一对引物，采用ＰＣＲ方法扩增其中的５３１ｂｐ的ＤＮＡ片段，纯化后通过质粒载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）转化大肠杆菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ构建ｇｔｆＢ基因部分ＤＮＡ克隆，为变链菌基因检测做准备。

家蚕尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶基因(BmUGT004965)的克隆和表达谱分析

糖基化作用在抑制和排除生物体一系列内生和外生有毒化合物的过程中非常重要,尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶(UGTs)参与了这一过程。在分析家蚕基因组中存在的UGT基因时选取其中的一个基因进行生物信息学分析与分子生物学实验,经分子克隆和表达谱分析,将该基因命名为BmUGT004965,其开放读码框(ORF)长1 578 bp,编码525个氨基酸,预测分子质量60.3 kD,等电点9.13。该基因编码蛋白的N端具有一段由19个氨基酸组成的信号肽序列,而且N端和C端各有一段疏水的跨膜区。将该基因cDNA与家蚕基因组序列进行比对表明其具有4个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。将家蚕BmUGT004965基因与人类、果蝇、昆虫杆状病毒、植物及已报道的家蚕UGT基因进行氨基酸水平的比对,显示氨基酸序列一致性为20%～30%;多重序列比对结果表明C端序列的保守性高于N端区域,可能与UGT具有2个主要的功能域有关。实时定量RT-PCR检测表明,在5龄第3天家蚕幼虫的9种组织中,BmUGT004965基因只在丝腺和脂肪体中有表达,且丝腺中的表达丰度明显高于脂肪体,这与基因芯片的结果一致,推测这种特异的表达方式可能与其特异的功能有关。

基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的培养基优化

对基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的培养基进行了优化,首先通过单因素试验,挑选出对菌株产酶有较大影响的因子及浓度范围,再通过两水平析因试验和最陡爬坡试验确定显著影响因子和浓度拐点,最后采用响应面分析法确定得到培养基成分的最佳配比为:甘油10.74g·L-1,酵母提取物51.85g·L-1,酵母蛋白胨10g·L-1,磷酸氢二钾22.82g·L-1,磷酸二氢钾2.85g·L-1。与原始培养基生产水平相比,采用优化培养基后,酶活提高了48.4%。

家蚕触角富集UDP葡萄糖醛酸基转移酶基因的克隆与表达分析(英文)

糖基化作用在抑制和排除一系列内生和外源化合物的毒性方面起重要作用,一系列尿苷二磷酸-糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases,UGTs)参与了糖基化反应过程。为了解家蚕中的UDP葡萄糖醛酸基转移酶的生理作用,克隆和表达了家蚕触角富集UDP葡萄糖醛酸基转移酶基因BmUGT013829。BmUGT013829基因cDNA全长1 545 bp,编码蛋白含有514个氨基酸残基。Western blotting检测发现BmUGT013829在家蚕脂肪体、头部、体壁和中肠组织中表达,在中肠组织的表达量低,在头部高量表达。免疫组织化学试验结果显示,BmUGT013829在头部的触角中表达水平最高。研究结果表明,BmUGT013829是一种触角富集尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶,推测其在嗅觉中扮演着重要角色。

家蚕不同茧色品种中尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶(UGT)基因的表达差异

尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶(UGT)是动物糖基化作用的关键酶。黄酮类色素是家蚕天然彩色茧中主要色素之一,桑叶中的黄酮色素在蚕体内需通过糖基化修饰才能够进行生物转化。为了研究UGT对家蚕茧色的影响,选取在家蚕绿色茧品种大造丝腺或中肠中有表达的7个家蚕UGT基因(UGT59、UGT30、UGT60、UGT34、UGT86、UGT89、UGT65),用RT-PCR方法对这些基因在白茧品种C108和皓月、绿茧品种大造和G1、黄茧品种Y12和黄茧限性品种Ys的丝腺、中肠和生殖腺组织中的表达进行了定性与定量分析。结果显示,上述品种中UGT89和UGT65基因只在丝腺特异表达;UGT86基因在丝腺的表达量最高,无茧色特异性;UGT60和UGT34基因在有色茧品种的中肠组织特异性表达;UGT59和UGT30基因在绿茧品种的丝腺和中肠组织特异性高量表达,UGT30基因在不同茧色品种还存在mRNA转录本的差异,显示出茧色特异性。对限性黄茧品种Ys的调查显示,UGT60和UGT86基因的表达在生殖腺存在性别差异,而在丝腺和中肠组织没有性别差异。提示UGT60和UGT34基因的表达与天然彩色茧色素在中肠的吸收有关,UGT59和UGT30基因表达与绿茧色形成有关,而UGT60和UGT86基因在生殖腺的差异表达与性别可能存在关联。

山葡萄类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的表达分析

为了探究VAm3GT蛋白表达和在山葡萄体内酶学特征及生物学功能,进一步证实克隆所获得目的基因的准确性。利用实时定量PCR法对山葡萄果皮8个不同转色时期类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(VAm3GT)的表达量进行了分析,并通过双酶切、连接转化等方法将VAm3GT基因克隆到原核表达载体pET28a上,构建原核表达重组质粒pET28a-VAm3GT。重组质粒转化至E.coli BL21后经不同浓度的IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析表明,在适宜的IPTG诱导浓度下,VAm3GT基因在大肠杆菌BL21中得到高效表达,表达的融合蛋白分子质量约为50.19 ku,成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达。

变形链球菌葡萄糖基转移酶基因片段的亚克隆序列测定

采用PCR方法体外扩增变链菌NG8gtfB基因531bpDNA片断，纯化后构建了含该片段的克隆并进行了DNA序列测定，为从分子水平揭示变链菌的致龋机制提供信息。

茶树脱落酸β-葡萄糖基转移酶基因CsAOG的克隆和表达分析

脱落酸(ABA)β-葡萄糖基转移酶(abscisate beta-glucosyltransferase)是ABA分解代谢途径中的关键酶,在维持植物体内ABA正常生理水平上发挥着重要作用。通过RACE法克隆了茶树中ABAβ-葡萄糖基转移酶基因CsAOG,NCBI登录号为MF370238。CsAOG全长为2 108 bp,ORF大小为1 443 bp,无内含子,该基因编码480个氨基酸,分子量约为53.26 kDa,等电点为5.58,亚细胞定位于细胞质。CsAOG蛋白具有葡萄糖基转移酶(UDPGT)保守结构域。通过MEME分析工具在CsAOG序列中获得了9个保守元件。由系统进化和蛋白互作分析可知,CsAOG位于UGT73分支,且UGT73B4与UGT73B5的互作最强。实时荧光定量结果表明,叶中CsAOG表达水平最高,根部次之,茎中最低;在越冬期间,乌牛早CsAOG表达量先上调后下调,最后维持在较低水平;舒茶早和黄山早芽CsAOG表达量呈下调趋势。赤霉素处理后,乌牛早CsAOG表达量上调;高温胁迫后CsAOG表达量呈先升后降的趋势,12 h时表达量最高,而低温胁迫时表达量变化不大。通过对CsAOG基因的研究,为理解ABA在调控茶树生长发育和抗逆机制中的作用提供了理论基础。

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT)基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b(+)中,构建了表达载体pET-20b(+)/cgt,并将其转化表达宿主E.coliBL21(DE3)。对重组菌E.coliBL21/pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件:葡萄糖8 g/L,乳糖0.5 g/L,蛋白胨12 g/L,酵母膏24 g/L,K2HPO472 mmol/L,KH2PO417 mmol/L,CaC l22.5 mmol/L;初始pH为7.0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90 h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22.1 U/mL,与来源菌P.macerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3 L发酵罐中发酵,90 h后胞外酶比活达到22.6 U/mL,证实了工业化放大的可能性。

变异链球菌葡萄糖基转移酶转录调控因子的研究进展

葡萄糖基转移酶是变异链球菌自身合成的一种重要的固有酶,是变异链球菌重要的致龋因子,它以蔗糖作为代谢底物,合成生物膜重要的胞外多糖葡聚糖,葡聚糖一方面介导细菌蔗糖依赖的生物膜形成,另一方面当外源性糖源缺乏时,被降解供细菌继续代谢。因此可以通过控制葡萄糖基转移酶而控制龋病的发生发展。本文就变异链球菌葡萄糖基转移酶基因转录的调控因子作一综述。

基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的培养基优化

所谓的基因工程就是利用现有的基因拼接技术以及DNA重组技术在分子水平上对基因实施比较复杂的操作,也就是将外源基因重新导入受体细胞中,这样一来,根据受体细胞自身的复制、转录、翻译等工作的持续进行,能够将外源基因所拥有的性状很好地表达出来。主要论述的是基因工程中大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的培养基优化具体操作以及成果和结论,希望通过全文的论述,能够更好地给我国未来基因工程研究提供有价值的参考。

α-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株YLW-8的鉴定

[目的]鉴定α-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株YLW-8。[方法]通过分析YLW-8菌株的形态、生理生化反应及16Sr DNA基因序列鉴定菌株的种类,并对YLW-8产α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)基因进行序列测定和同源性分析。[结果]菌株YLW-8根据形态、生理生化反应初步鉴定其属于芽孢杆菌属(Bacillus),其16Sr DNA基因序列(Gen Bank登录号为KF010776)与多粘芽孢杆菌同源性高达99%以上。结合形态、生理生化特性以及16Sr DNA序列分析,鉴定YLW-8菌株为多粘芽孢杆菌(Paenibacillus)。YLW-8产α-CGTase基因测序结果在NCBI中进行比对,与Paenibacillus macerans的α-CGTase基因的同源性为99%(GenBank登录号为KF010775)。[结论]该研究为后续α-CD工业化生产研究提供技术参数和理论依据。