甜茶树苷H对高糖致小鼠肾足细胞损伤的作用研究

[目的]探究甜茶树苷H抑制NLRP3/ASC/Caspase1通路从而改善高糖导致的小鼠肾足细胞(MPC-5)的损伤作用。[方法]试验采用不同浓度(0、3.25、7.5、15、30、60、120μmol/L)甜茶树苷H分别孵育MPC-5细胞,通过CCK-8法检测细胞活力,判定安全给药浓度。将MPC-5细胞分为空白对照组(CON)、D(+)-无水葡萄糖等渗对照组(MA)、高糖组(HG)以及不同浓度(3.25、7.5、15μmol/L)甜茶树苷H组(CY3.25、CY7.5和CY15组)。HG和不同浓度甜茶树苷H组分别加入30μmol/L D(+)-无水葡萄糖,MA组加入5.5 mmol/L D(+)-无水葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇,CON组加入不含FBS的DMEM培养基,孵育细胞24 h后,CY3.25、CY7.5和CY15组培养基更换为不同浓度甜茶树苷H,并再次孵育细胞24 h。收集细胞,采用CCK-8法和乳酸脱氢酶(lactate hydrogenase,LDH)法分别检测细胞活力和损伤程度;利用碘化丙啶(PI)荧光染色法检测细胞凋亡率;通过免疫荧光法观察MPC-5细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)共定位情况;采用ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素-1β前体(Pro-IL-1β)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量;通过Western blotting检测NLRP3、ASC、半胱氨酸天冬酶1(Caspase1)/半胱氨酸天冬酶1前体(Pro-Caspase1)以及肾结蛋白(Desmin)、肾病蛋白(Nephrin)、线粒体裂变因子(MFF)、胶原Ⅳ(CollagenⅣ)蛋白表达量。[结果]与0μmol/L甜茶树苷H组相比,7.5和15μmol/L甜茶树苷H组细胞活力显著升高(P<0.05),30、60和120μmol/L甜茶树苷H组细胞活力显著降低(P<0.05)。因此,后续选择3.25~15μmol/L为甜茶树苷H的安全作用浓度。采用以上安全作用浓度甜茶树苷H处理细胞,结果显示,与HG组相比,CY3.25、CY7.5和CY15组细胞活力显著升高(P<0.05),细胞上清液中LDH活力显著降低(P<0.05),且呈现剂量依赖性;CY7.5和CY15组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。免疫荧光法检测结果显示,与CON组相比,HG组细胞中NLRP3、ASC荧光增强且出现红绿荧光标记重叠现象;与HG组相比,CY3.25、CY7.5组细胞中NLRP3、ASC荧光减弱,未观察到红绿荧光标记重叠现象,CY15组细胞中NLRP3、ASC无荧光阳性标记。ELISA检测结果显示,与HG组相比,CY15组细胞中IL-1β和Pro-IL-1β释放量比值显著降低(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,与HG组相比,CY15组细胞中NLRP3、ASC、Desmin、MFF、CollagenⅣ及Caspase1/Pro-Caspase1表达量均显著降低(P<0.05),Nephrin蛋白表达量显著升高(P<0.05)。[结论]甜茶树苷H能改善高糖诱导导致的MPC-5细胞损伤,其主要通过改变NLRP3/ASC/Caspase1通路中相关蛋白的表达,从而发挥对细胞的保护作用。

甜茶树甜味成分研究

从甜茶树[Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaya]中分离得到4个(Ⅰ～Ⅳ)有强甜味的化合物。根据理化性质和光谱数据,鉴定化合物Ⅰ的结构为20,24-环氧-达玛烷-(3β、12β、24R)-120-O-α-1,吡喃鼠李糖基-25-羟基-3-O-α-(5’-O-乙酰基)-L-呋喃阿拉伯糖甙,为一新的天然产物,命名为甜茶树甙A(cyclocarioside A)。