甜菊醇糖苷生物合成关键基因的导入和鉴定分析

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)生产的甜菊醇糖苷因具有高甜度、低热能、不参与人体内代谢兼具保健功能等特点,被誉为最有发展前途的新糖源。从甜叶菊叶片克隆了甜菊醇糖苷生物合成途径中的关键基因SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1,构建植物基因过量表达载体,以单独或组合的形式将这些基因导入到甜叶菊中,获得转基因植株。与野生型对照植株相比,单独导入SrUGT85C2的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量提高,总糖苷、莱包迪苷A含量及占比没有明显变化;单独导入SrUGT91D2m的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量显著降低,而甜菊醇双糖苷含量显著增加;单独导入SrUGT76G1的转基因植株中,总糖苷含量显著提高,莱包迪苷A含量达到10%以上,比对照提高了2倍,而甜菊糖苷含量减少了一半。3个基因组合同时导入的转基因甜叶菊植株与单独导入SrUGT76G1的转基因甜叶菊植株类似,其总糖苷、莱包迪苷A含量及其占比均显著提高。这些结果为以后通过分子生物学技术来调控甜菊醇糖苷生物合成关键基因的表达,培育莱包迪苷A含量高的高品质甜叶菊新品系提供了理论依据和技术方法。

甜菊醇和异甜菊醇与DNA作用方式的研究

甜菊醇是新型甜味剂甜菊糖在人体内的代谢产物,在酸性环境中可重排成异甜菊醇,它们都是重要的药物合成中间体。研究甜菊醇和异甜菊醇与DNA的作用方式有助于理解其药理或细胞毒性。以小牛胸腺DNA(CT-DNA)为模板,通过考察甜菊醇和异甜菊醇对CT-DNA熔点和粘度的影响,以及甜菊醇和异甜菊醇与CT-DNA体系紫外吸收的变迁,初步推断甜菊醇和异甜菊醇都是以沟槽方式与CT-DNA结合;异甜菊醇与CT-DNA的作用比甜菊醇与CT-DNA作用强。

甜菊醇糖苷生物合成途径关键酶基因KA13H的克隆及序列分析

本研究利用RT-PCR方法从甜叶菊叶片中分离了一个与甜菊醇糖苷生物合成密切相关的基因KA13H,对该基因的ORF、编码产物结构、同源性比对及次级结构等进行了生物信息学预测分析,同时初步分析该基因的组织表达和原核表达。经DNAMAN6.0软件分析,该基因编码一条分子量为54.476kD的由476个氨基酸残基组成的多肽,含有典型的细胞色素P450的血红素结合位点FXXGXXXCXG,TMPRED程序预测其C-端含有一个明显的跨膜区MIQVLTPILLFLIFFVFWKVY,是一个典型的细胞色素P450基因。推断的KA13H编码产物与其它生物合成相关细胞色素P450同源比对和系统发生分析表明,该蛋白与苜蓿(Medicago truncatula)CYP716A12和云杉(Sitka spruce)CYP720B1的一致性较高,分别为51%和46%,推测KA13H可能与CYP716A12和CYP720B1具有类似的功能。KA13H次级结构分析结果表明,KA13H与CYP74A2的一致性仅为15%,但是它们却有着类似的次级结构,都含有6个基质识别位点(SRSs)。半定量RT-PCR分析表明:KA13H在根、茎、叶和花中呈组成型表达,叶和花中的表达丰度较高;将该基因融合到原核表达载体pGEX-4T-1中,在原核中得到了成功表达。根据本研究结果,我们推测KA13H可能在甜菊醇糖苷生物合成过程中发挥着重要作用,该基因的克隆和表达分析为进一步深入了解甜菊醇的生物合成过程中相关酶和基因的功能奠定了基础。

甜菊醇糖苷生物合成及关键酶研究进展

甜菊醇糖苷(steviol glycosides,SGs)是甜叶菊(Stevia rebaudian)叶片中一类天然甜味剂,具有高甜度、低热量、无毒副作用等特点,同时还具有一定的药理作用。植物体内主要是通过甲基赤藓糖醇(MEP)途径形成牻牛儿牻牛儿焦磷酸(GGPP),之后该物质在古巴焦磷酸合酶(CPPS)、贝壳杉烯合酶(KS)、贝壳杉烯氧化酶(KO)、糖菊苷转移酶(UGTs)等一系列结构功能各异的酶的作用下最终生成甜菊醇糖苷。SGs生物合成途径的调控及该途径中关键酶的研究已成为目前国内外生物学领域的一大热点。综述了甜叶菊SGs生物合成途径和参与该途径中的关键酶及其基因的研究进展,并展望了其应用前景。

高效液相色谱法测定甜菊糖苷中甜菊醇的含量

建立高效液相色谱法测定甜菊糖苷中甜菊醇的含量。色谱条件:色谱柱为Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为乙腈-水(50∶50);流速1.0 mL/min;检测波长213 nm;柱温30℃;进样量10μL。线性范围为1.046μg/mL^52.3μg/mL(r=0.9997),加标平均回收率为96.60%,RSD为0.51%(n=6)。本方法准确度高、精密度高、重复性好、简捷易操作,可以作为甜菊糖苷中甜菊醇含量的测定方法。

甜菊醇、异甜菊醇抑制α-葡萄糖苷酶和HMG-CoA还原酶的分子机制研究

本文研究了甜菊醇、异甜菊醇抑制高血糖、高血脂代谢关键酶α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA还原酶活性的分子机制。采用分光光度法测定甜菊醇、异甜菊醇对α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA还原酶抑制率,用双倒数作图法研究甜菊醇、异甜菊醇的酶抑制动力学,利用AutoDock软件对甜菊醇、异甜菊醇与α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA还原酶的结合模式进行分析。结果表明:甜菊醇、异甜菊醇对α-葡萄糖苷酶的IC;分别为70.75、49.65 mg/L,采用竞争性与非竞争性相混合的方式抑制α-葡萄糖苷酶;甜菊醇、异甜菊醇对HMG-CoA还原酶的IC;分别为46.29、36.66 mg/L,竞争性抑制HMG-CoA还原酶。分子对接的分析结果表明甜菊醇、异甜菊醇分别位于α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA还原酶的疏水口袋中,与多个氨基酸残基结合,并存在疏水作用。本研究对于开发新型的食源性α-葡萄糖苷酶和HMG-CoA还原酶抑制剂,推动甜菊醇、异甜菊醇在食品和医药领域的应用具有一定的参考意义。

一种作用于花青素和甜菊醇的甜菊糖基转移酶的基因克隆和功能分析(英文)

本文对一种新的甜菊糖基转移酶进行了基因克隆和功能分析。获得的基因cDNA全长1419bp,编码473个氨基酸,蛋白质分子量约53.2K Da。与常见的糖基转移酶基因比较,相似性达44%以上,且具有糖基转移酶的保守序列。体外异源表达获得的融合蛋白,具有在花青素类和甜菊醇等糖基受体上转糖基的酶活性。在对一系列不同底物的酶活性进行比较后,推测这种糖基转移酶在体内参与了甜菊糖苷的合成。结果表明,具有广泛的底物活性的类黄酮类糖基转移酶,在甜菊体内不仅对类黄酮转糖基,而且在生成水溶性甜菊糖苷的过程中也扮演重要的角色。

基于分子对接研究甜菊醇、异甜菊醇对赤霉素受体GID1的作用机制

开发安全的类赤霉素分子,用分子对接的方法分析甜菊醇、异甜菊醇与赤霉素受体GID1作用分子机制,阐明其结合自由能和相互作用关系,为进一步开发利用提供理论依据。通过检索文献确定赤霉素受体为GID1蛋白,以GA_(3)为对照物,利用AutoDock vina软件进行分子对接。结果表明,GA_(3)、甜菊醇、异甜菊醇与GID1蛋白的结合自由能分别为-11.10 kcal/mol,-10.81 kcal/mol,-11.26 kcal/mol,说明甜菊醇和异甜菊醇两种小分子都能与赤霉素受体GID1蛋白形成稳定结合,且异甜菊醇的作用效果强于赤霉素GA_(3)。

甜菊醇及其衍生物的研究进展

甜菊醇是天然产物甜菊糖苷的水解产物,分子具有对映-贝壳杉烯型骨架结构,具有抗高血压、降低血糖、抑制癌细胞等生理活性。本文对近年来有关甜菊醇的结构改造及其生物活性的研究进展作了初步的总结。

甜菊醇调控巨噬细胞ABCA1蛋白表达

甜菊糖能够降低机体的胆固醇水平,而甜菊醇(steviol,STE)是甜菊糖在机体内的主要天然水解物。作者研究了甜菊醇对小鼠巨噬细胞J774A.1三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)的调控作用,并探讨其可能的分子机制。首先,利用MTT方法建立了甜菊醇的使用条件及浓度。采用免疫蛋白印记、细胞免疫荧光以及荧光定量PCR方法,发现在环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的类似物8-(4-硫代氯苯基)腺苷-3',5'-环磷酸盐(8-(4-chlorophenylthio)adenosine 3',5'-cyclic monophosphate,CPT)的协作下,甜菊醇能够显著提高ABCA1在蛋白质水平和基因转录水平的表达;且甜菊醇可以显著上调ABCA1的上游调控基因肝X受体(LXRα)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)的mRNA表达水平和蛋白质表达水平,但对过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)的表达无明显调控作用。结果表明,甜菊醇能够调控ABCA1蛋白表达的机制,可能与PPARα、LXRα的表达有关。本研究为后续治疗和预防动脉粥样硬化具有指导意义,对甜菊糖食品的应用提供了一定的参考作用。

盐酸或氨基磺酸催化水解斯替夫苷制备甜菊醇

分别以盐酸或氨基磺酸为催化剂水解斯替夫苷(St),研究底物质量浓度、反应温度、催化剂用量和反应时间对斯替夫苷水解的影响,着重考察了斯替夫苷的转化率、甜菊醇的产率和异甜菊醇的产率。其中,盐酸催化水解斯替夫苷的最优工艺条件为:反应温度95℃,底物质量浓度400 g/L,盐酸浓度0.04 mol/L,反应时间28 h;在该条件下,根据高效液相色谱分析计算得到斯替夫苷转化率接近100%,甜菊醇产率达83.6%,异甜菊醇产率达12.4%。氨基磺酸催化反应的工艺条件为:反应温度95℃,斯替夫苷质量浓度400 g/L,氨基磺酸浓度0.05 mol/L,反应时间31 h;在该条件下,根据高效液相色谱分析计算得到斯替夫苷转化率接近100%,甜菊醇产率达81.5%,异甜菊醇产率达11.7%。

甜叶菊中9种甜菊醇糖苷积累与其生物合成关键基因表达量的相关性

为了研究甜叶菊中主要甜菊醇糖苷积累特点与其生物合成关键基因表达量的关系,本研究选取3个品种甜叶菊(普赛科3号、中山2号、同心)为试验材料,定期在幼苗期、营养生长期、花蕾期采收植株的上位3对叶片,采用液相色谱-质谱法(LC-MS)检测9种甜菊醇糖苷,即莱宝迪苷A、B、C、D、E、F(RA、RB、RC、RD、RE、RF)、甜菊糖苷(ST)、甜茶糖苷(RBS)和杜尔可苷A(DA)含量,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析糖苷生物合成的3个UDP-糖基转移酶(UGTs)关键基因,即SrUGT91D2e、SrUGT74G1和SrUGT76G1的表达水平。结果表明,甜味糖苷RA在普塞科3号营养生长期含量最高(1.60 mg·g^(-1)),RD在普塞科3号的花蕾期含量最高(1.58 mg·g^(-1));苦味糖苷ST、RC、DA在普塞科3号中的积累量显著低于中山2号和同心(普塞科3号ST为0.50 mg·g^(-1)、RC为0.26 mg·g^(-1)、DA为0.01 mg·g^(-1)),因此普塞科3号可作为甜味糖苷高产选育品种。对甜菊醇糖苷生物合成关键基因表达量与糖苷含量进行相关性分析,甜味糖苷RD和RA的含量与其关键影响因子SrUGT91D2e和SrUGT76G1的表达量显著相关,苦味糖苷RC、ST、DA的含量与其关键影响因子SrUGT74G1的表达量显著相关。本试验为甜叶菊不同甜度糖苷的品种选育及采收时间的确定提供了依据。

甜叶菊甜菊醇糖苷生物合成关键酶基因表达量与莱宝迪苷A含量的相关关系

莱宝迪苷A(rebaudioside,RA)是甜叶菊甜菊醇糖苷中的主要甜味成分,其含量受到生物合成中多个酶基因的影响。本研究以6个甜叶菊品种为材料,利用实时荧光定量RT-PCR测定RA生物合成途径中UGT85C2、UGT91D2m和UGT76G1三个关键酶基因的表达量,并与其RA含量进行相关性分析。结果显示UGT76G1基因相对表达量与RA含量有极显著相关关系(p=0.008),而UGT85C2和UGT91D2m基因表达量与RA含量无相关关系,说明UGT76G1基因的表达对RA合成有着较为重要的影响。研究结果可为利用基因工程手段人为调控甜菊醇糖苷的生物合成,提高RA的含量提供理论依据。

棘孢曲霉转化甜菊糖为甜菊醇及纯化莱鲍迪苷A

【目的】本工作对棘孢曲霉固体发酵抽提酶液转化甜菊糖进行了研究,并对转化产物进行鉴定及纯化分析。【方法】用高效液相色谱、液质联用及红外光谱等方法对转化新产物进行鉴定,对上清液中莱鲍迪苷A(RA)成分进行纯化。【结果】棘孢曲霉酶液在10 h内对甜菊糖中的甜菊苷(SS)、莱鲍迪苷C(RC)进行高效特异性转化,以沉淀的形式析出的转化产物经鉴定为甜菊醇,转化率高达98.0%,分离提纯后纯度为95.2%,回收率达84.0%.由于甜菊醇的沉淀分离,留在溶液中的RA更易被纯化。RA通过树脂吸附分离的回收率为80.5%.【结论】棘孢曲霉酶液对甜菊糖的一次转化可以同时得到甜菊醇和莱鲍迪苷A两种产品,是一种经济高效的工艺。

高效液相色谱法测定甜叶菊中的3个甜菊醇糖苷的含量

目的：建立高效液相色谱法分析甜叶菊中3个甜菊醇糖苷含量。方法：采用Poroshell 120 EC—C18色谱柱（4．6mm×150mm，2．7μm），以乙腈-磷酸水溶液（30：70）为流动相进行分离，在紫外检测波长210nm下进行检测，外标法定量。结果：3个甜菊醇糖苷的检出限为1．0—1．2mg·kg^-1，定量限为2．5—3．0mg·kg^-1；在50～1000mg·L^-1的浓度范围内线性良好，相关系数为0．9999—1．000；瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷C和甜菊苷的加标回收率分别为92．8％、87．2％、90．3％，RSD分别为3．9％、2．7％、4．8％；精密度的RSD分别为1．2％、2．1％、1．3％；重复性的RSD分别为3．3％、6．4％和4．7％。结论：本方法操作简便，快速，分离度和准确度高，可用于甜叶菊原料的质量控制。

饮料中甜菊糖苷水解条件的优化及高效液相色谱法测定

该文建立高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法测定饮料中甜菊醇的定量分析方法,并优化饮料中甜菊糖苷水解成甜菊醇的条件。采用3 mmol/g路易斯酸水解,无水乙醇提取,以70%乙腈水溶液(体积分数)作为流动相,使用ZORBAX SB-C18色谱柱。结果表明,甜菊醇在5.0μg/mL~100.0μg/mL的浓度范围内线性关系较好(r2≥0.999),平均回收率在81.9%~92.3%,相对标准偏差在1.17%~3.67%。饮料中甜菊糖苷转化甜菊醇的最佳工艺条件:催化剂为氯化铁,提取温度100℃,甜菊糖苷浓度300 mg/mL,提取时间3 h,催化剂含量3 mmol/g。

天然活性成分甜菊苷化学结构修饰的研究进展

对天然活性成分甜菊苷的化学结构修饰进行综述,主要包括配糖基的修饰,在苷元的C-13,C-20位的R1和R2位进行取代,用于改善甜度和甜味,以及对糖尿病的治疗;苷元的修饰,在苷元的C-15,C-16和C-17位进行取代,药理活性表现在降低血糖、降低血压以及作为生长激素等方面。

典型甜菊糖苷的抗氧化和抗炎活性

本文以6种代表性甜菊糖苷及其肠道代谢物甜菊醇以及甜菊醇的重排异构体异甜菊醇为对象,研究了上述甜菊化合物的抗氧化性及其对鼠巨噬细胞Raw264.7的细胞毒性和抗炎活性。结果表明,所试甜菊糖苷在100μg/mL内对鼠巨噬细胞的Raw264.7均无细胞毒性,也不会诱导炎症反应;其中异甜菊醇抗炎效果最优,100μg/mL时相对于脂多糖刺激后产生的NO含量降低了约30.7%。所试甜菊糖苷对DPPH·和·OH两种自由基的清除率最高分别为24.8%和13.8%,其对DPPH·的清除能力具有结构相关性,但对·OH清除率均低,无结构相关性;而甜菊酚对DPPH·和ABTS^+·清除率分别为92.1%和29.6%,即甜菊提取物的自由基清除率主要由甜菊酚产生。

甜菊糖及其衍生物的研究进展

详细介绍了甜菊糖及其衍生物甜菊醇的性质、生理功能,综述了其在医药、食品和日用化工方面的应用研究进展。此外,探讨了甜菊糖及其衍生物的应用前景。

不同基因型甜叶菊光合生理特性与产量品质比较

为了筛选适宜甘肃河西绿洲灌区种植的甜叶菊及高光效育种材料,对引进的14个不同基因型甜叶菊种质资源光合生理特性、产量和甜菊醇糖苷含量进行差异性分析。结果表明,不同基因型甜叶菊整个生育期光合速率(photosynthetic rate,Pn)、蒸腾速率(transpiration rate,Tr)、气孔导度(stomata conductance,Gs)变化均呈"低-高-低"的单峰曲线,且峰值都出现在现蕾期。各次测定表明各基因型间Pn、Tr和Gs与干叶产量、甜菊醇糖苷含量具有一定的相关性。HX-2和ZY-0911两个基因型光合速率和干叶产量均较高,分别较平均值提高9.18%、8.66%和6.41%、9.68%。基因型间甜菊醇糖苷含量差异达到极显著水平(P<0.01),BY-0915-2和ZY-0911甜菊醇糖苷含量最高,分别为15.33%和14.30%,较平均增加31.31%和22.49%。综合分析得出,甘肃河西绿洲灌区要引种高光效甜叶菊进行栽培或作为育种亲本时,应首选引自安徽的8(ZY-0911)。