甜菜坏死黄脉病毒不同分离物外壳蛋白的研究

应用SDS PAGE和PCR SSCP分析技术,对新疆不同地区的BNYVV分离物进行分析,结果表明:12个分离物蛋白质外壳的蛋白亚基分子量均为20kD;来自库尔勒的K4和K5分离物编码外壳蛋白质的基因不同于其他地区和本地区的分离物,二者彼此间也不相同。

甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物自然缺失突变体缺失区域的定位分析

以甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物 (BNYVVNM )总RNA为模板 ,经RT -PCR扩增 ,分别获得RNA2、RNA3和RNA4自然缺失突变体的cDNA克隆。序列分析结果表明 ,RNA2自然缺失突变体在 75kD通读蛋白编码区C端缺失 34 8个核苷酸 (缺失位置nt1488～nt1835 )。RNA3在其 2 5kD蛋白编码区内缺失 36 0个核苷酸 (缺失位置nt72 9～nt10 88)。RNA4的自然缺失区域位于 31kD蛋白编码区 ,缺失 40 2个核苷酸 (nt70 2～nt110 3) ,缺失未造成移码 ,仍可编码产生一个由 148个氨基酸组成的蛋白。BNYVV内蒙分离物上述 3个RNA组分的自然缺失突变体的缺失区域 ,与国外报道的德国G1分离物和日本S分离物的自然缺失区域非常相似。同时 ,对自然缺失的可能机制及其在病害防治上的应用进行了讨论。

应用RT-PCR技术检测甜菜坏死黄脉病毒

为了更加准确地检测患有丛根病的甜菜植株中BNYVV病毒的含量,实验采用了RT-PCR的方法分别从26株待测甜菜的根中扩增获得了324bp的BNYVV病毒基因片断。通过调整反转录cDNA模板的浓度,研究发现,当cDNA模板稀释到100倍时,能更加精准地检测到不同丛根病染病植株中BNYVV病毒含量的差异。同时,半定量PCR的统计结果进一步表明.当待测植株中BNYVV病毒的相对含量低于阳性对照的一半时,甜菜丛根病病症并不明显;而当其相对含量超过阳性对照的1.3倍时,甜菜受害严重,有些几乎死亡。本检测方法为更加及时、快捷、准确和系统地检测甜菜植株的染病程度打下了良好的基础。

用免疫电镜技术检测和研究甜菜坏死黄脉病毒和黑色焦枯病毒

本文利用免疫电镜技术准确地检出带有甜菜坏死黄脉病毒的病株，从而正确评价甜菜丛根病防治效果；对甜菜黑色焦枯病毒进行了免疫电镜形态学观察并证实了抗血清制备试验效果良好。

甜菜坏死黄脉病毒对甜菜幼苗膜脂过氧化的影响

实验以抗丛根病性不同的4个甜菜品种为材料,研究了甜菜坏死黄脉病毒对甜菜幼苗膜脂过氧化的影响。结果表明,病毒侵染后甜菜抗病品种幼苗MDA、H2O2含量,CAT、APX、SOD、POD及PAL活性均有不同幅度的变化;甜菜坏死黄脉病毒作用的第2d、第3d时,以上各指标达到峰值,且甜菜抗病品种H2O2含量、CAT、APX、SOD、POD及PAL活性显著高于感病品种;甜菜感病品种MDA含量显著高于抗病品种。结果说明,在甜菜坏死黄脉病毒作用下,甜菜抗病品种通过诱导抗氧化酶类活性升高,降低膜脂过氧化水平,从而提高甜菜对甜菜坏死黄脉病毒的抗性。

新疆甜菜坏死黄脉病毒RNA5的检测及核苷酸序列分析

利用RT-PCR方法,对12个新疆不同地区的甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)分离物和美国的BN-TX及黑龙江的He分离物进行检测,结果表明,只有库尔勒地区的所有分离物和来自黑龙江的He分离物含有RNA5,其他地区的分离物未检测到RNA5。选K2和He分离物进行序列分析,测得K2分离物长为1323 nt,He分离物长为1300 nt;与国内外报道的中国包头B分离物、呼和浩特H、日本的D5分离物和法国的F72分离物的RNA5序列相比,序列同源性K2为95.0％～96.8％,He为96.0％～99.3％,均含有一个开放阅读框(ORF),由此推导出的各分离物的氨基酸同源性,K2为93.0％～96.5％,He为96.5％～99.6％。其变异主要集中在富含A的区域。

RT-PCR检测甜菜坏死黄脉病毒及总RNA提取方法研究

为选择较为适合甜菜总RNA的提取方法,构建和优化RT有效体系。以田间甜菜叶片、根毛及根表皮为材料,研究了提取甜菜总RNA的方法以及利用RT-PCR技术进行甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)的检测。研究表明,获得良好的RT-PCR扩增效果,RT体系中dNTPs浓度、引物、AMV、模板RNA的浓度要分别达到1 mmol/L,1μmol/L,0.1 U/μL,0.01μg/μL较好。PCR体系中dNTPs浓度、引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+的浓度要分别达到0.1 mmol/L,0.1μmol/L,0.01U/μL,1.48 mmol/L效果较好。RT-PCR法对BNYVV检测,可作为甜菜品种(育种材料)早期抗丛根病性鉴定的依据之一。

dsRNA-RT-PCR技术在甜菜坏死黄脉病毒属不同分离物鉴定中的应用

从新疆甜菜主产区采集的 60份具丛根病症状的根、叶标样 ,经分离、纯化获得 7个代表性病毒分离物 .上述分离物分别人工接种昆诺阿藜 ,显症后 ,提取人工接种的昆诺阿藜患病组织的 ds RNA,RT-PCR检测表明 ,7个分离物均为甜菜坏死黄脉病毒 ( BNYVV) .ds RNA-RT-PCR技术具有灵敏度高、稳定性强及操作简便、安全等优点 ,可有效地完成对甜菜坏死黄脉病毒属 ( Benyvirus)不同分离物的鉴定 .其应用在国内尚属首次报道 .

甜菜坏死黄脉病毒感染甜菜细胞的超微病变比较研究

用透射电镜观察了甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)对甜菜抗、感丛根病品种块根细胞超微结构的影响。结果表明,BNYVV对感病品种的细胞超微结构破坏严重,整个细胞变形,空泡化,细胞核结构发生紊乱,线粒体和高尔基体明显增多,细胞质中小液泡增多,在液泡膜边缘可见到一些纤细丝状物质的圆形或卵圆形小泡突入液泡中。而抗病品种细胞超微结构破坏较轻,寄主细胞产生一系列显著的结构防卫反应:形成细胞壁沉积物及液泡膜上显示出黑色颗粒状沉积物等,保证了胞内代谢相对稳定,为甜菜抗丛根病机理提供了细胞学基础。

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的原核表达载体和植物表达载体的构建

将克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）新疆分离物外壳蛋白（ＣＰ）基因的ｃＤＮＡ的ｐＧＥＢ３，用ＸｂａＩ切下，Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切下ｃＤＮＡ片段。用ＮｄｅＩ切开原核表达载体ｐＪＷ２，用Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切去小片段。将该ｃＤＮＡ与ｐＪＷ２大片段用Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＮＹＶＶＣＰ基因的表达载体ｐＪＷＢ４，转化到大肠杆菌ＤＨ５α。经培养和高温诱导，ｐＪＷＢ４成功地表达出了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白。将ｐＧＥＢ３和ｐＢＩ１２１用Ｘｂａｌ和ＢａｍＨＩ酶切Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＹＶＶＣＰ基因的植物表达载体，转化到ＤＨ５α，筛选出正向连结的阳性克隆ｐＢＩＢ３，转化入农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４），经用ＰＣＲ扩增和γ３２Ｐ标记的探针杂交约证实为阳性克隆。往甜菜植株中转化工作正在进行中。

甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达

将甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)内蒙古分离物的外壳蛋白基因亚克隆到pJW2上构建成在大肠杆菌中表达的载体。SDS-PAGE及Westexn blotting检测的结果表明,该表达载体在大肠杆菌DH5 α中经温度诱导后特异地表达21kD的甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白。经光密度扫描估测,其表达量占大肠杆菌总蛋白的19.5％

应用寄主植物筛选甜菜坏死黄脉病毒的无毒介体

病土培育藜、昆藜、老枪谷、虞美人、三白麦瓶草、繁缕 ,4周后用Nikon倒置显微镜检测 ,在藜的根中观察到介体甜菜多粘菌的游动孢子 ,把藜的根磨碎接种甜菜 ,8周后镜检观察到介体的休眠孢子 ,ELISA检测甜菜坏死黄脉病毒结果为阴性 。

甜菜坏死黄脉病毒RNA5对病毒致病性的影响

利用甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus,BNYVV)RNA5全长侵染性cDNA克隆体外转录获得的RNA5体外转录物,与只含有RNAl,2以及RNAl,2和3的两个BNYVV突变株BNYVV-HuO和BNYVV-Hu3的RNAs分别混合,并接种于寄主植物番杏(Tetragonia expansa)和甜菜(Beta vulgaris L).结果表明,RNA5是BNYVV中除RNA3以外的另一个病毒致病性相关分子,它的存在能够提高病毒的侵染效率和在寄主体内的积累水平,并与RNA3协同作用,导致病毒侵染后的症状表现加重.

甜菜坏死黄脉病毒RNA4的菌传功能分析

构建了甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）RNA4全长核苷酸序列以及5种编码区突变体的侵染性cDNA克隆.不同结构的RNA4体外转录物与只含有RNA1,2和3的BNYVV分离物总RNAs混合后分别接种寄主植物番杏（Tetragonia expansa）作为毒源,繁殖后接种甜菜,利用无毒甜菜多黏菌（Polymyxa betae）进行传毒实验.结果表明,RNA4编码区内各种缺失突变均能显著地抑制多黏菌的传播,但插入4个碱基的移码突变体对传毒没有影响,说明BNYVV RNA4中的部分核苷酸序列对于被真菌介体高效传播是必需的,并且可能是在RNA水平上具有功能.

甜菜丛根病研究进展

甜菜丛根病是一种发生在世界主要糖甜菜种植地区的土传病害,在缺乏有效控制的情况下会引起甜菜严重的产量损失。从4个方面叙述了近些年来与甜菜丛根病研究的相关进展:(1)甜菜坏死黄脉病毒(Beetnecrotic yellow vein virus,BNYVV)的基因组结构;(2)BNYVV的分类及与其他甜菜土传病毒的关系;(3)丛根病的检测方法;(4)丛根病的控制策略。最后对甜菜丛根病未来的研究发展方向进行了展望。

新疆甜菜品种(系)基因转化和再生体系的建立

根据植物发育的分子遗传学理论筛选到一种不依赖基因型、高频率再生、易重复、简单快速及周期短的组织培养体系,并利用农杆菌介导法将甜菜坏死黄脉病毒基因导入新疆甜菜品种(系),获得转基因植株,建立了新疆主栽甜菜品种(系)基因转化和再生体系。

第三代转基因甜菜植株的检测

采用降落PCR的方法对第三代转基因甜菜进行了检测。从152株中检测到4株转基因甜菜,检出率为2.6%。检出的4株转基因植株中,有两株不抽薹。本研究获得2个单株遗传转化种子材料。实验表明经过三代的培养基本可以确定所检测的甜菜为可稳定遗传的转基因甜菜。