甜菜夜蛾核型多角体病毒颗粒剂制备及其抗逆性能评价

甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)具有专一性和高效性,可以有效控制甜菜夜蛾种群,而且对环境和生态安全。为了提高甜菜夜蛾核型多角体病毒的稳定性,以海藻酸钠为包埋材料,通过优化载体用量和进料速率等条件,采用喷雾法制备了病毒颗粒剂,并对其相关性能进行了表征和评价。结果表明:海藻酸钠质量浓度为1%,进料速率为13mL/min时制备的病毒颗粒剂呈不规则形状,颗粒剂产率79.4%,病毒含量1.0×10^(6)PIB/g,D_(50)在130μm左右。经颗粒剂海藻酸钠包埋的甜菜夜蛾核型多角体病毒具有良好的热稳定性和抗紫外性能,同时不会影响其对甜菜夜蛾幼虫的致病力。

甜菜夜蛾核多角体病毒(SeMNPV)gp37基因的克隆及序列分析

通过鸟枪法克隆了甜菜夜蛾核多角体病毒 (SeMNPV)基因组DNAEcoRⅠ酶切的 2 2kb片段 .序列分析表明 ,该片段含有gp37基因 .SeMNPVgp37基因的开放阅读框为 80 1个核苷酸 ,编码 2 6 8个氨基酸 ,预测蛋白质相对分子质量为 30 40 0 .在gp37基因起始密码子上游有一典型的杆状病毒晚期基因启动子序列ATAAG .同其它昆虫杆状病毒和昆虫痘病毒GP37/Fusolin蛋白的比较结果表明 ,SeMNPVGP37与已知gp37/fusolin基因的氨基酸序列同源性较高 (5 0 %～ 6 8% ) ,在其蛋白序列内存在类似的保守区和可能的N_连接糖基化位点 .在SeMNPVgp37基因下游存在一个完整阅读框和部分egt基因序列 .

不同虫龄甜菜夜蛾幼虫实验种群对核型多角体病毒的敏感性

利用经稀释10-1和10-3的甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)初提液,对甜菜夜蛾各龄幼虫不同实验种群进行饲毒,以研究不同龄期宿主幼虫对SeNPV的敏感性差异.结果表明,宿主幼虫虫龄与其对病毒的敏感性呈显著负相关,虫龄越小,对病毒的敏感性越高.低浓度病毒(8.24×104PIB/mL)感染1～3龄幼虫,患病率达89%以上,患病个体死亡率达94%以上.高浓度病毒(8.24×106PIB/mL)能导致89.6%以上高龄幼虫死亡.SeNPV导致宿主幼虫死亡的时间相对较短.Weibull模型可较好地拟合各试验结果.

甜菜夜蛾核型多角体病毒对甜菜夜蛾幼虫的毒力测定

室内毒力测定表明，在一定范围内，不同浓度甜菜夜蛾核型多角体病毒（SeNPV）感染甜菜夜蛾2龄幼虫后，浓度越高，甜菜夜蛾死亡率越高，开始死亡时间越早，全程感染至死亡的天数越短，致死中时（LT50）为2．44～5．60d，致死中浓度LC50=7．11×10^4 PIB／ml。以剂量为2×10^5 PIB／ml的SeNPV样品感染甜菜夜蛾1～4龄幼虫，低龄幼虫的死亡高峰期为4～5d，全程期为6～7d；3龄以上幼虫死亡高峰期为7d左右，全程期为10～12d。

利用甜菜夜蛾日本品系增殖核多角体病毒

比较了甜菜夜蛾3种品系增殖甜菜夜蛾核多角体病毒(SeNPV)的效果。结果表明,利用甜菜夜蛾日本品系幼虫增殖SeNPV产量最高,其平均单头病毒含量分别比广州品系和荷兰品系高19 6%和53 3%;病毒总含量分别高20 4%和116 7%。在此基础上,进一步研究了虫龄、感染浓度和饲养密度对用甜菜夜蛾日本品系幼虫增殖SeNPV的影响,确定了利用甜菜夜蛾日本品系增殖SeNPV时,以上3因子的最佳条件为:在27±1℃下用1×108PIB/ml的SeNPV感染5龄初幼虫,并按30头/dm2的密度饲养。

甜菜夜蛾核多角体病毒泛素基因的克隆及原核表达

甜菜夜蛾核多角体病毒(Spotoptera exigua multi-nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)泛素基因ubiquitin被克隆和序列分析.该基因编码区全长243bp,编码80个氨基酸残基,预计蛋白质分子量为9.4kDa。将这一ubiquitin基凶克隆到原核表达载体pET-28a上.转化至BL21 (DE3)中,用IPTG进行诱导表达,对表达的条件进行了优化。用异源的泛素单克隆抗体检测目的蛋白,Western blot实验证明所表达的蛋白是泛素蛋白。同时,我们制备了特异性的抗体,为以后的研究工作做了基础。通过计算机软件Gendoc对不同来源的泛素进行分析,结果显示,病毒中的泛素与真核细胞中的泛素相比较,泛素的氨基酸序列有较大的变化,杆状病毒的泛素基因在分子进化上可能有比较独特的途径。

甜菜夜蛾核多角体病毒基因组13.7～21.6m.u.区域的分析

甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodopteraexiguamulticapsidnucleopolyhedrovirus,SeMNPV)基因组13 7～21 6m u 区域是SeMNPV的重组热点区。以SeMNPV美国分离株SeUS1为模板,长片段PCR对SeUS1的13 7～21 6m u 区域扩增,得到11 3kb,2 0kb和0 7kb3个片段。对照已发表的SeMNPV基因组序列,11 3kb片段是具完整SeMNPV序列基因型的产物,2 0kb和0 7kb片段表明SeUS1中还存在两种缺失突变株。对2 0kb和0 7kb片段的序列分析揭示了这两株突变株在缺失部位的DNA一级结构。对三株重组SeMNPV病毒(SeXD1、SeXD2和SeXD3)的分析发现,它们和野生型病毒SeUS1中的一个基因型一样,均缺失了SeMNPVnt18513～29105之间长10593bp的片段,暗示SeUS1中一株自发形成的缺失突变体在离体细胞中具有复制优势。将该片段基因排列与其它10种基因组序列已测定的杆状病毒比较,发现两个在GroupⅡNPVs中保守的基因簇。最大简约性法对部分基因的系统发育分析表明,缺失片段中某些基因可能存在于杆状病毒分化之前的病毒基因组中。

甜菜夜蛾核多角体病毒sod基因的克隆及原核表达

甜菜夜蛾核型多角体病毒中国株(Spotoptera exigua MNPV-Z)超氧化物歧化酶基因(sod)业已被克隆及在大肠杆菌中进行了表达,证明了SeMNPV-Z的sod基因产物确有SOD活性,其活力单位约为291.19U/mL培养液。DNA测序结果表明SeMNPV-Z的sod基因编码151个氨基酸,与人的sod1基因的核苷酸的同源性为50％,与LdNPV、HaSNPV、HcNPV、AcNPV和BmNPV的sod基因的同源性分别为64％、63％、63％、65％、63％。

保幼激素类似物对重组甜菜夜蛾核多角体病毒SeXD1增殖的影响

用重组甜菜夜蛾核多角体病毒SeXD1感染甜菜夜蛾幼虫,并于同龄期点滴保幼激素类似物Methoprene（ZR-515）,研究其对SeXD1增殖的影响。研究表明,用5×10^7PIB/ml的SeXD1感染甜菜夜蛾五龄幼虫,并以2μg/头Methoprene点滴处理效果最佳,其感染死亡率、平均单头病毒含量、病毒总产量分别为95.3%、8.6×10^8PIBs/头和2.45×10^11PIBs;比对照提高65.1%、115.0%和264.1%。研究了Methoprene对染毒及未染毒宿主消化生理的影响。结果显示,Methoprene处理不仅延长甜菜夜蛾幼虫历期,增加其取食量,还显著提高幼虫的食物转化率。

甜菜夜蛾核多角体病毒BAC-TO-BAC外源基因表达系统的建立

用直接克隆法将miniF lacZ attTn7 kan片段插入甜菜夜蛾核多角体病毒 (Spodopteraexiguamulticapsidnucleopolyhe drovirus,SeMNPV)美国分离株 (SeUS1)基因组的多角体蛋白基因框内 ,miniF是大肠杆菌F因子复制子 ,携带miniF的重组病毒能够在大肠杆菌中低拷贝稳定复制 ,称为bacmid。由于SeUS1由不同的SeMNPV基因型组成 ,每个bacmid携带了一种病毒基因型 ,所有bacmid构成了SeUS1分离株的BAC文库。REN对 111个bacmid分析表明 ,SeUS1分离株中除了包含具有完整SeMNPV遗传信息的基因型外 ,还包括不同类型的缺失基因型。将具有完整SeMNPV基因组的基因型SeBAC10转染昆虫细胞 ,可产生子代病毒 ,故SeBAC10是一种在真核细胞和原核细胞中均能复制的穿梭质粒。因为SeBAC10中多角体蛋白基因 (Seph)被插入失活 ,将Seph作为报告基因通过位点特异性重组方式插入位于LacZ框内转座子Tn7的附着靶位点attTn7,得到重组SeBAC10 (即SeBAC10ph)转染甜菜夜蛾培养细胞Se3 0 1后 ,细胞出现典型的病理变化 ,核中出现多角体 ,证明SeMNPVBAC TO

甜菜夜蛾核多角体病毒(SeMNPV)ORF100和ORF101基因的克隆、表达与纯化

目的:构建甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)ORF100(Se100)和ORF101(Se101)基因的原核表达载体,表达并纯化两种蛋白。方法:用PCR方法扩增Se100和Se101基因,分别将它们克隆至原核表达载体pQE-30上,转化宿主菌M15[pREP-4],用IPTG进行诱导表达,表达产物用Ni-NTA金属螯合层析法进行纯化,SDS-PAGE检测表达的目的蛋白。结果:构建了分别含有Se100和Se101基因的原核表达质粒pQE100和pQE101;SDS-PAGE检测显示,表达的两个融合蛋白的分子量分别为15kDa和31kDa,比预期分子量稍大;Ni-NTA亲和层析结果显示:6×His-Se100和6×His-Se101融合蛋白主要存在于pH值为4.5的缓冲液中。结论:成功克隆并高效表达了Se100和Se101两个基因,有效纯化了两种蛋白,为深入进行基因的功能研究奠定了基础。

甜菜夜蛾核多角体病毒Se29基因的克隆与序列分析

[目的]克隆得到甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exiguamulticapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)ORF29全长基因(Se29)。[方法]用PCR的方法扩增Se29基因,将其克隆至pMD18-T载体上,获得了重组质粒T-Se29,进行序列测定和分析。[结果]获得大小为642 bp左右的序列,扩增序列与GenBank登录序列(Genbank accession No.NC_002169)核苷酸同源性100%。序列分析结果表明,Se29基因编码蛋白(SE29)存在一个可能的跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,1个微体C末端靶信号位点。蛋白序列比对结果表明,SE29与棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovir-us,HaSNPV)ORF128(Ha128)的编码蛋白(HA128)具有较高的同源性,其在病毒侵染过程中的作用值得关注。[结论]成功克隆出Se29基因,为研究其在病毒侵染过程中的作用奠定了试验基础。

甜菜夜蛾多核壳型核型多角体病毒vp39基因的克隆与表达(英文)

参照苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒 ( Ac MNPV)衣壳蛋白基因 vp3 9的序列设计引物 ,采用PCR技术扩增了甜菜夜蛾核型多角体病毒的约 1 .3 kb片段。通过将该片段亚克隆至原核表达载体p ET-2 8构建出重组表达质粒 p ET-Se3 9.以 p ET-Se3 9转化 E.coli BL2 1 .经 IPTG诱导后 ,Se MNPVvp3 9基因高效表达 .SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量为 3 9KD,并且表达量在 IPTG诱导 4 h达到最高水平 .

甜菜夜蛾核多角体病毒VP39蛋白在苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒中的功能研究

【目的】构建表达甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)VP39蛋白的vp39假型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica MNPV,AcMNPV),明确SeMNPV VP39是否能取代AcMNPV VP39在AcMNPV中行使功能,为深入探究杆状病毒的核衣壳装配机理打下理论基础。【方法】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统在AcMNPV vp39缺失型重组bacmid(bAcvp39KO)的基础上构建携带SeMNPV vp39基因、绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein,egfp)和多角体蛋白基因(Polyhedrin,polh)的重组病毒(vAcSevp39:FLAG)。利用Western blotting检测分析SeMNPV vp39在vAcSevp39:FLAG转染的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)IPLB-Sf21-AE clonal isolate 9(Sf9)细胞中的表达情况,通过荧光显微镜观察vAcSevp39:FLAG在Sf9中的感染和扩散情况,采用病毒滴度测定并绘制病毒生长曲线检测vAcSevp39:FLAG的感染性芽生型病毒粒子产量,并以电子显微镜观察vAcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中的形态发生情况。【结果】Western blotting检测结果表明,SeMNPV VP39能在vAcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中获得表达;荧光显微镜观察和病毒生长曲线测定结果表明,在vAcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中无感染性的芽生型病毒粒子产生,与AcMNPV vp39缺失型重组病毒(vAcvp39KO)的现象一致;电子显微镜观察发现,与vAcvp39KO不同的是,在vAcSevp39:FLAG转染的细胞中虽然未产生核衣壳,但在感染细胞的核中存在大量空的透明长管状衣壳结构,表明SeMNPV VP39能挽救vAcvp39KO的衣壳结构装配,但在AcMNPV中不具备装配核衣壳的能力。【结论】SeMNPV VP39在AcMNPV中虽能形成衣壳结构,但不能有效装配核衣壳,导致无芽生型病毒粒子和包埋型病毒粒子产生。

我国甜菜夜蛾核型多角体病毒研究新进展

核型多角体病毒是昆虫病毒中最大的类群,它能够专一性地侵染并杀死一种或者几种农林害虫,并对害虫天敌、环境和人畜无害,是一种值得推广的绿色生物农药。为有效利用绿色生物农药防治病虫害,对我国近几年关于甜菜夜蛾核多角体病毒的毒力、病毒制剂研究与生产、田间应用及药效试验、增效剂研究、分子生物学等方面进行了阐述,并提出了新的展望和应用需求。

30亿PIB/mL甜菜夜蛾核型多角体病毒悬浮剂防治甘蓝甜菜夜蛾田间药效试验

30亿PIB/m L甜菜夜蛾核型多角体病毒悬浮剂是由江西省新龙生物科技有限公司开发的新型杀虫剂,为了研究其杀虫活性,进行了防治甘蓝甜菜夜蛾田间药效试验。试验结果表明,30亿PIB/m L甜菜夜蛾核型多角体病毒SC对甜菜夜蛾的防治效果突出,制剂施用量300 m L/hm2,防治效果达80%以上,持效期长达7d以上,可以兼治其他害虫。30亿PIB/m L甜菜夜蛾核型多角体病毒SC对甜菜夜蛾具有良好的防治效果,对作物安全,具有良好的推广应用前景。

甜菜夜蛾核多角体病毒VP39基因的克隆与生物信息学分析

VP39是杆状病毒核衣壳主要结构蛋白基因,为研究VP39在杆状病毒生活周期中的可能作用,用PCR方法克隆得到甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multicapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)VP39全长基因(Sevp39),将其克隆至pMD18-T载体上,获得重组质粒T-Sevp39,进行序列测定和生物信息学分析。序列测定结果表明:扩增序列大小为981 bp,与GenBank登录序列(Genbank accession No.NC_002169)核苷酸同源性99.9%,第308位的碱基由G突变成T。序列分析表明:Sevp39编码蛋白(Sevp39)有多个可能的N-糖基化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个N-豆蔻酰化位点。蛋白序列比对结果表明:Sevp39与绝大部分杆状病毒VP39的序列相似性均大于30%,在Sevp39同源蛋白中有6个高度保守的半胱氨酸残基(Cys)。蛋白质二级结构预测结果显示:Sevp39可能形成7个α螺旋和14个β折叠,高度保守的Cys^17参与了β折叠的形成。上述结果为研究Sevp39在病毒入侵和病毒复制过程中所担负的功能奠定了实验基础。

甜菜夜蛾核多角体病毒Se62基因的克隆与结构分析

[目的]克隆并分析甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multicapsid nucleopoledrovirus,SeMNPV)ORF62全长基因(Se62)。[方法]采用PCR的方法扩增Se62基因,将其克隆至pMD18-T载体上,获得了重组质粒T-Se62,进行序列测定和分析。[结果]获得大小为1 128 bp左右的序列,扩增序列与GenBank登录序列(No.NC_002169)核苷酸同源性100%。序列分析表明,Se62基因编码蛋白(SE62)存在明显的跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点。蛋白序列比对结果表明,SE62属于杆状病毒P48蛋白超级家族成员,与苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa califorica multicapsid nucleopoledrovirus,AcMNPV)P48蛋白的同源性为52%,其在病毒复制中的作用值得关注。[结论]成功克隆出Se62基因,为研究其在病毒复制中的功能奠定了基础。

病毒杀虫剂——甜菜夜蛾核型多角体病毒

甜菜夜蛾核型多角体病毒是利用现代生物技术，从染病死亡的甜菜夜蛾体内提取而来的。该产品属微生物源、核型多角体病毒、低毒专一性杀虫剂，纯天然微生物农药。主要制剂：20亿PIB／毫升悬浮剂，300亿PIB／克水分散粒剂。该病毒在正常使用技术条件下对人畜、家禽、鱼鸟等低毒、