甜菜无融合生殖单体附加系M14大孢子发生的超微结构

应用透射电镜技术探求甜菜单体附加系M14(Beta vulgaris L.,VV+1C,2n=18+1)有性生殖大孢子与二倍体孢子生殖大孢子发生时的超微结构特征,了解有性生殖和无融合生殖起始细胞的超微结构差别。甜菜单体附加系M14为兼性无融合生殖体,大孢子发生有韭型、蝶须型和蓼型3种类型。韭型和蓼型大孢子发生时均起源于大孢子母细胞,二分体之前从形态结构上难以区分;减数分裂前期I,细胞核中出现核液泡,形成联会复合体,细胞质改组,细胞壁上沉积胼胝质。韭型大孢子发生时,只进行减数第一次分裂,不发生减数第二次分裂,形成二分体,珠孔端二分体细胞退化,合点端二分体细胞发育为二倍体功能大孢子。蓼型二分体的珠孔端细胞在减数第二次分裂前或分裂过程中退化,合点端细胞经减数第二次分裂形成两个细胞,构成三分体,最终合点端大孢子发育为单倍体功能大孢子。蝶须型大孢子发生是M14中唯一的二倍体孢子无融合生殖方式,其大孢子发生时大孢子母细胞不发生减数分裂,不出现核液泡,未形成联会复合体,无细胞质改组,细胞壁上缺乏胼胝质的沉积和缺乏胞间连丝,这些可作为二倍体孢子无融合生殖的鉴定指标。

甜菜无融合生殖单体附加系M14花粉发生与发育的超微结构研究

运用透射电子显微镜技术,对甜菜无融合生殖单体附加系M14的小孢子发生、雄配子体发育以及相应的花药壁发育过程进行超微结构的观察研究,以阐明甜菜无融合生殖单体附加系M14花粉发生与发育超微结构特点以及花粉败育的时期和败育的细胞学特征.结果显示:(1)小孢子母细胞减数分裂正常,分裂期间细胞质具有明显的细胞质改组"现象,主要表现在核糖体减少,质体、线粒体的结构发生规律性的变化,有利于孢子体向配子体的转变.M14减数分裂的胞质分裂为同时型,前期Ⅱ和中期Ⅱ形成细胞器带";正常发育的花粉,小孢子分裂形成营养细胞和生殖细胞;生殖细胞脱离花粉壁,生殖细胞游离于营养细胞的细胞质中,最初具细胞壁,而后消失,且生殖细胞壁成分与花粉内壁成分相似.(2)三细胞型的成熟花粉含有一个营养细胞和两个具有尾突的精子;每个精子通过两层质膜与营养细胞隔开,含有一个大的精核,长尾突内含少量的细胞质以及纤丝状结构.(3)生殖细胞和精子中缺乏质体.(4)花粉的败育起始于小孢子,大部分受阻于单核-二细胞花粉期,其败育特征为花粉内液泡吞噬作用导致细胞器解体,绒毡层细胞过早解体或肥大生长致使营养供应受阻,可能是导致单核-二细胞花粉败育的主要细胞学原因.研究表明,白花甜菜第九号染色体的附加可能是导致M14大量花粉败育的遗传学因素.

甜菜无融合生殖单体附加系M14大孢子发生期间细胞壁胼胝质的变化

应用脱色苯胺蓝诱导荧光法观察了甜菜单体附加系M14(Beta vulgarisL,.VV+1C、2n=18+1)正常有性生殖与二倍体孢子生殖时,大孢子发生期间细胞壁内胼胝质的变化。结果表明,韭型(Allium odorum-type)胚囊大孢子发生时,自大孢子母细胞的珠孔端细胞壁内出现胼胝质荧光,并逐渐扩展到整个细胞壁,中期Ⅰ至末期Ⅰ细胞壁呈现胼胝质荧光。二分体时,珠孔端大孢子细胞壁内胼胝质荧光消失,二分体之间的横壁以及合点端功能大孢子的侧壁上荧光明显。二倍体功能大孢子的合点端细胞壁内的胼胝质荧光消失。单核胚囊形成后,其细胞壁内无胼胝质荧光,而退化的大孢子细胞壁胼胝质荧光显著。蝶须型(Antennaria-type)胚囊大孢子发生时,大孢子母细胞、二倍体功能大孢子的细胞壁均无胼胝质荧光。蓼型(Polygonum-type)胚囊大孢子母细胞减数分裂时,其珠孔端细胞壁出现胼胝质荧光,并逐渐扩展到整个细胞壁。二分体、三分体、四分体时期,胼胝质荧光主要存在于大孢子之间的横壁上,侧壁内胼胝质荧光较弱。退化的大孢子细胞壁胼胝质荧光明显,功能大孢子细胞壁上缺少胼胝质荧光。此外,还讨论了大孢子母细胞减数分裂与细胞壁内沉积胼胝质之间的相关性。

甜菜无融合生殖单体附加系M14雌配子体的发生与发育

利用常规石蜡制片法,对甜菜单体附加系M14(Beta vulgarisL.VV+1C、2n=18+1)雌配子体的发生与发育进行了研究,结果表明:二倍体孢子生殖雌配子体为韭型(Allium odorum-type)和蝶须型(Antennaria-type),有性生殖雌配子体为蓼型(Polygonum-type)。韭型和蝶须型的大孢子母细胞发育成为二倍体雌配子体,蓼型大孢子母细胞形成单倍体的雌配子体。在二倍体孢子生殖雌配子体发育过程中,出现发育迟缓,胚囊败育等情况,正常发育的雌配子体只有25%。讨论了二倍体孢子生殖雌配子体发生与发育特点。

甜菜无融合生殖单体附加系M14雌配子体发育的超微结构观察

【目的】阐明甜菜无融合生殖单体附加系M14雌配子体发育的超微结构特征。【方法】以甜菜无融合生殖单体附加系M14(Beta vulgaris L.VV+1C、2n=18+1)为实验材料,利用电子显微镜技术对其雌配子体的发育过程进行研究。【结果】甜菜无融合生殖单体附加系M14为兼性无融合生殖体,二倍体孢子生殖为蝶须型(Antennaria-type)和韭型(Allium odorum-type),有性生殖为蓼型(Polygonum-type)。蝶须型为主要发育方式,超微结构特征为:雌配子体发育速度较快,从功能大孢子直到细胞化雌配子体时期,细胞器的种类与数量呈现增长趋势:细胞核核仁较大,存在核仁泡,核孔明显;核糖体数量多;线粒体的数量一直较多,从二核雌配子体出现内嵴,膜的结构变得清晰,八核雌配子体的线粒体基质呈电子透明状,细胞化后期恢复到原来的状态;质体的数量变化不大,形状多样,有的含淀粉粒;内质网呈分枝的管状或交织成索状分布在细胞核、液泡或细胞壁附近;高尔基体的数量相对较少,但在未退化的助细胞中十分丰富,活跃地分泌小泡;脂滴一直都存在,常与液泡及线粒体相互靠近;细胞化后期,绝大多数雌配子体的助细胞先后退化,极少数雌配子体只有一个助细胞退化,另一个宿存。韭型与蓼型雌配子体发育速度较慢,与蝶须型相比,直到单核雌配子体时期未见细胞器种类与数量发生明显变化。蝶须型与韭型、蓼型雌配子体仅在功能大孢子与单核胚囊时期通过是否有胼胝质壁加厚以及珠孔端有无退化的细胞痕迹进行区分。【结论】蝶须型、韭型、蓼型雌配子体发育过程中的超微结构特征差异明显,蝶须型雌配子体从功能大孢子至细胞化时期,雌配子体体积增大,细胞器的种类与数量随之增加,呈现代谢旺盛状态。推测蝶须型雌配子体在其后的发育中占优势。单核雌配子体之前依据珠孔端是否有退化细胞痕迹以及有无胼胝质壁加厚可将蝶须型与韭型、蓼型从结构上予以区分。韭型、蓼型从功能大孢子至单核雌配子体时期,雌配子体的体积以及细胞质的成熟程度均呈缓慢增长趋势。推测在其后的发育过程中大量退化。

甜菜无融合生殖单体附加系M14的小孢子发生与雄配子体发育的观察

利用常规石蜡制片技术 ,对甜菜无融合生殖单体附加系M1 4品系 (BetavulgarisL .)小孢子发生、雄配子体发育进行了研究 .结果表明 :1 .小孢子母细胞减数分裂过程中的胞质分裂为同时型 ,四分孢子为四面体形 .2 .单核小孢子经两次有丝分裂 ,产生营养细胞和两个精子 ,成熟的花粉粒为三细胞型 .单核小孢子第一次有丝分裂后 ,80 %的花粉败育 ,可育花粉只有 2 0 % .3.花药壁由五至六层结构组成 ,表皮 ,药室内壁 ,2至 3层中层 ,绒毡层为分泌型 .4.同一朵花中 ,在前期 ,雄蕊的发育早于雌蕊的发育 ,在后期 ,当花粉成熟时 ,雌配子体也达到成熟 .提供了花蕾的大小与雌、雄蕊发育的相关数据 .

甜菜单体附加系M14无融合生殖的细胞胚胎学研究

利用常规研究方法,对甜菜单体附加系M 14品系(B eta vu lg aris L.,VV+1C、2n=18+1)的生殖方式进行细胞学与胚胎学研究.结果表明:(1)甜菜单体附加系M 14的4代细胞学检查表明:染色体组分别为VV+1C、2n=18+1;VV+0、2n=18+0;VV+2C、2n=18+2;VVV+0、2n=27+0;VVV+1C、2n=27+1;VVV+2C、2n=27+2等,其中VV+1C、2n=18+1的植株传递率平均为96.7%,表现为稳定传递,具有二倍体孢子无融合生殖特性;其余各种分离植株的传递率总计为3.25%,有性生殖发生率较低.(2)胚胎学研究表明,二倍体孢子无融合生殖的胚珠中,珠孔处看不到花粉管,胚囊没有发生受精作用.2个助细胞提前退化,半数卵细胞的极性与正常卵细胞相反;卵与次生核不经受精而自发分裂,卵细胞自发分裂产生无性胚,次生核自发分裂产生核型胚乳,而且次生核自发分裂早于卵细胞分裂;有性生殖胚珠中,珠孔处可见多条花粉管,胚囊里见到精卵融合的图像.表明甜菜单体附加系M 14是以二倍体孢子无融合生殖为主要繁殖方式,有性生殖为次要敏殖方式的兼性无融合生殖体.

甜菜无融合生殖单体附加系的繁殖传递特性

由栽培甜莱（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）和白花甜菜（Ｂ．ｃｒｏｏｌｌｉｆｌｏｒａ Ｚｏｓｓ．）杂交分离获得的甜菜无融合生殖单体附加系具有高频率近１００％传递的特性．经过四代传递分析，平均传述率达９５％以上，表现为稳定传递．在其传递后代中，分离出ＢⅢ后代（ＶＶ＋１Ｃ＋Ｖ，２ｎ＝２８）、二倍体（２ｎ＝１８）非共倍体（２ｎ＝２９，２ｎ＝２０）等．无融合生殖单体附加系后代结实株数、结实率、单株种粒产量与其二倍体姊妹相比皆明显下降，说明它们的繁殖特性受到破坏，表现出雌配子体突变特征．本文对高频传递和分离产生各种类型的原因及意义进行了讨论．

甜菜单体附加系M14种子形成方式

以具有显性标记性状的红叶柄栽培甜菜为父本与绿叶柄M14甜菜杂交,观察F1植株叶柄颜色;利用SSR标记分析甜菜M14世代间的遗传相关性。结果显示,甜菜单体附加系M14传递率维持在较高水平;在人工去雄授粉条件下,F1代植株叶柄颜色均为红色,甜菜M14通过接受外来遗传物质及精卵结合的有性生殖方式繁殖种子;M14株系中不存在与其母本株SSR标记基因型精确相同的植株。表明甜菜M14通过精卵融合的有性生殖而非无融合生殖形成种子。Southern杂交结果显示,从甜菜M14反转得到的栽培甜菜染色体中普遍含有白花甜菜DNA,暗示甜菜M14形成雌配子体及卵子过程中存在减数分裂过程和较高频率的染色体畸变。推测甜菜单体附加系M14高频传递现象可能是由于附加的白花甜菜第9染色体具有杀配子功能。

甜菜单体附加系M14的RNA提取方法比较

目的:对甜菜无融合生殖单体附加系M14品系的叶和花总RNA提取方法进行对比,消除其提取产量低、RNA降解、DNA干扰、多糖干扰、蛋白质干扰和杂质干扰等缺陷。方法:采用6种方法进行RNA提取分析。结果:在RNA提取过程中加入约1/3倍体积柠檬酸钠等除糖剂,能够有效去除多糖干扰,大大提高所提RNA的质量。获得最佳RNA提取方法。

甜菜单体附加系M14与栽培甜菜蛋白质的SDS-PAGE比较分析

利用SDS-PAGE电泳比较分析了甜菜单体附加系M14与栽培甜菜在花蕾期蛋白水平上的差异.对甜菜单体附加系M14与栽培甜菜花蕾期蛋白的SDS-电泳图分析后,样品分别获得41与40条蛋白质条带,以栽培甜菜为对照甜菜单体附加系M14在花蕾期特异表达了3条蛋白质带,表达缺失了2个条带,初步推测其中可能有与M14进行无融合生殖相关蛋白质.

甜菜单体附加系M14花蕾cDNA文库的构建

为了克隆甜菜单体附加系M14无融合生殖相关基因 ,采用cDNA文库快速构建法制备了M14花蕾cDNA文库。根据甜菜单体附加系M14无融合生殖的细胞胚胎学研究结果 ,提取甜菜M14花蕾三个关键时期的RNA ,分离纯化mRNA ,以Oligo(dT)为引物 ,在逆转录酶的作用下 ,合成第一链cDNA ,进而合成第二链cDNA。含有EcoRⅠ和NotⅠ粘性末端的双链cDNA在T4DNA连接酶的作用下与载体λZAP臂相连 ,并对连接产物进行体外包装 ,得到噬菌体颗粒 ,即甜菜单体附加系M14花蕾cDNA文库。经大肠杆菌寄主菌株XL1-blueMRF’平板检测 ,三个文库滴度分别为 2 .8× 10 5pfu·mL-1、1.6× 10 5pfu·mL-1和 3.5× 10 5pfu·mL-1,克隆重组率为 83%、78%和 81%。

不同激素水平对甜菜单体附加系M14产生愈伤组织的影响

在植物细胞全能性学说的基础上,采用单因子实验,分析比较了细胞分裂素6-BA（6-苄基氨基嘌呤）,生长素2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）,生长素NAA（萘乙酸）等3种植物激素对甜菜M14单体附加系产生愈伤组织生长的影响。实验结果表明,诱导愈伤的最佳培养基为MS＋6-BA（0.05mg/L）＋2,4-D（1.0mg/L）＋NAA（0.1mg/L）,6-BA的质量浓度为1.0mg/L时有利于芽的形成,NAA质量浓度为0.05mg/L时有利于形成愈伤组织。

利用mRNA差异显示技术分离甜菜M_(14)品系特异表达基因的cDNA片段

二倍体栽培甜菜与白花甜菜杂交、进一步回交而获得的单体附加系M14,其染色体组成中除了含有18条栽培甜菜染色体外,还附加有一条野生白花甜菜第9号染色体,该附加染色体通过母本的传递率为96.5%;单体附加系传递率如此高的原因是因为M14中有无融合生殖基因的存在。本实验采用mRNA差异展示技术对甜菜无融合生殖品系M14和正常有性生殖的二倍体栽培甜菜A2Y花蕾减数分裂时期的基因表达进行了差异分析。采用GT15A,GT15G,GT15C3种锚定引物,共筛选了20个随机引物,通过RT-PCR检测,获得了6个阳性差异表达的cDNA片段,应用NCBI的BLASTx软件对测序结果进行同源序列、相似序列检索,为进一步克隆无融合生殖基因提供侯选cDNA片段。

植物无融合生殖研究进展

植物无融合生殖是一种特殊的无性生殖方式 ,它不经过精卵融合即可繁殖后代 ,其二倍体子代基因型与母本精确相同 ,可以固定杂种优势 ,对于作物育种等工作具有巨大的经济意义。对无融合生殖的分类、遗传进化、发生机制、分子机理等方面进行了介绍。并对无融合生殖的一些最新的研究进展 :无孢子生殖专化基因组区、脱调节理论、基因组冲撞观点、表观遗传基因调节理论等进行了简要的评述。

应用斑点杂交方法对甜菜易位系传递率的分析

以白花甜菜特异的DNA重复序列 10 5 4作为探针 ,PCR法进行标记 ,对 16个株系共 2 6 4株进行了斑点杂交检测。结果表明 ,其后代总传递率达 5 0 4 % ,其中株系 11和株系 14的传递率高达 10 0 %和 83 3%。对高频传递株系的进一步研究 ,为确定其是否带有无融合生殖基因及进一步缩小无融合生殖基因的寻找范围提供了必要的研究基础。