24种香稻品种甜菜碱醛脱氢酶2基因突变位点的分析及分子标记开发

根据香型与非香型水稻甜菜碱醛脱氢酶2基因(badh2)在第2、第4内含子、第7外显子3处序列差异和第2外显子1处序列差异,分别设计了两类检测badh2第7和第2外显子突变的功能性分子标记引物M7和M2;利用两类引物,分别对属于第7外显子突变的香型水稻W香99075和第2外显子突变的香型水稻武香14、非香型水稻以及两种香稻分别与非香稻杂交的F1植株基因组DNA进行PCR检测后发现,M7和M2引物完全能够分别被用于以第7和第2外显子突变的香稻作为亲本,进行分子标记辅助培育香稻新品种的研究。M7引物综合考虑了badh2内含子和外显子两方面突变情况而设计的。以非香稻261S、分别发生第7和第2外显子突变的香稻品种W香99075和武香14为对照,使用M7和M2引物,对本实验室收集的另外22份香稻品种进行badh2突变位点检测,结果可将这些香稻分为badh2第2外显子突变类型、第7外显子突变类型和外显子未发生突变类型,同时明确了大多目前在上海等周边地区种植的香稻品种的badh2所属的突变位点。开展本研究为利用分子标记辅助选育香型水稻新品种研究奠定了重要的基础。

乙醛脱氢酶2基因多态性与急性脑梗死的相关性研究

目的探讨乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性与急性脑梗死(ACI)的相关性,同时观察不同病灶大小ACI患者4-羟基壬烯醛(4-HNE)水平。方法选取该院2019年8月至2021年8月收治的130例ACI患者作为ACI组,根据头颅CT或MRI检查结果所示病灶大小将ACI组进一步分为腔隙性脑梗死组(33例)、小梗死组(41例)和大梗死组(56例)。另选取同期130例体检健康者为对照组,采用聚合酶链反应-荧光探针法对ACI组与对照组人群ALDH2基因位点的多态性进行定性检测。比较ACI组与对照组,以及不同病灶大小ACI患者血清4-HNE水平。结果ACI组ALDH2突变基因型AA比例高于对照组,差异有统计学意义(χ^(2)=4.599,P<0.05)。ACI组A等位基因频率(29.6%,77/260)高于对照组的21.5%(56/260),差异有统计学意义(χ^(2)=4.455,P=0.035)。大梗死组ALDH2突变基因型AA比例高于腔隙性脑梗死组,差异有统计学意义(P<0.05)。大梗死组A等位基因频率(35.7%,40/112)高于腔隙性脑梗死组的21.2%(14/66),差异有统计学意义(χ^(2)=4.133,P<0.05)。ACI组4-HNE水平为(17.79±7.62)ng/mL,高于对照组的(11.83±7.52)ng/mL,差异有统计学意义(t=6.348,P<0.05);腔隙性脑梗死组4-HNE水平为(16.29±8.71)ng/mL,低于小梗死组的(18.30±5.27)ng/mL和大梗死组的(18.31±8.36)ng/mL,差异均有统计学意义(t=-1.225、-1.187,P<0.05)。ACI组中ALDH2基因纯合突变基因型AA患者血清4-HNE水平为(32.65±6.44)ng/mL,高于纯合野生型GG患者的(13.24±3.25)ng/mL和杂合基因型GA患者的(19.89±2.39)ng/mL,差异有统计学意义(t=11.228、6.670,P<0.05)。结论ALDH2基因多态性与ACI的发生密切相关,血清4-HNE水平升高会加大ACI的发病风险。

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达

质粒ｐＬＳ９含有１５ｋｂ的编码菠菜甜菜碱醛脱氢酶（ＢＡＤＨ）基因。经限制酶切后克隆到植物表达载体的３５Ｓ启动子和ＰｏｌｙＡ终止子之间。经农杆菌介导转化烟草，获得９０多株抗卡那霉素再生植株，经ＰＣＲ检测证明６０％以上再生植株含有ＢＡＤＨ基因。转基因植株经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ＢＡＤＨ酶活性测定，ＢＡＤＨ酶活性特异性染色法检查和耐盐性分析，证明菠菜ＢＡＤＨ基因在烟草正常表达，在叶绿体和胞液中均有ＢＡＤＨ酶存在。

转甜菜碱醛脱氢酶基因植物的耐盐性研究

将山菠菜甜菜碱醛脱氢酶（ＢＡＤＨ）基因经农杆菌介导转入草莓、烟草，转基因植株中该基因的转录水平、ＢＡＤＨ活性及耐盐性均明显高于对照，膜的相对电导率和大分子渗漏值说明在盐胁迫下转基因植株的膜结构所受损伤小于对照。

转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因小麦的耐盐耐旱性

采用室内模拟盐、旱胁迫,结合田间实际测定的方法,对基因枪法获得的转BADH基因小麦多个株系的不同世代材料进行了耐盐、耐旱性鉴定。结果表明,在旱、盐胁迫条件下,转BADH基因小麦在种子萌发、幼苗生长、根系发育以及质膜保护等方面均比受体品种(对照)具有明显的优势;在田间生长条件下的转基因株系,其叶片蒸腾强度比对照明显降低,而离体叶片失水速率与对照没有明显差别。

转甜菜碱醛脱氢酶基因马铃薯的抗旱耐盐性

通过根癌农杆菌介导法将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入马铃薯栽培品种甘农薯2号,经PCR、Southern和Northern杂交证明BADH基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定表明对照植株没有BADH酶活性,各转化株系在胁迫前后BADH酶活性近似,在2.1～10.5U之间。BADH酶活性与叶片的相对电导率呈一定的负相关(y=–3.774x+57.083,r=0.989**)。在NaCl和PEG胁迫下,转基因植株生长正常,株高比对照提高0.41～1.00cm,单株重量比对照增加10%～35%,说明外源BADH基因的导入提高了马铃薯植株对干旱和盐碱的抗性。

三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的克隆及序列分析

以藜科植物山菠菜甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)基因的保守区设计引物 ,通过RT PCR技术 ,从三角叶滨藜cDNA中分离了两个BADH基因片段BADH3 和BADH5,并利用巢式PCR、cRACE以及 3′ RACE获得全长BADH3 。测序结果表明 ,BADH3 和BADH5之间的核苷酸同源性为 81 % ,其推测的氨基酸序列同源性 80 %。全长BADH3 核苷酸序列长 1 81 5bp ,79～ 1 5 78bp为一个开放阅读框架 ,推测的氨基酸序列全长 5 0 0个氨基酸残基 ,相对分子质量为 5 4 70 0 ,pI为 5 5。其核苷酸序列和推测的氨基酸序列与山菠菜同源性分别为 95 %和 93%。由三角叶滨藜 3′端部分BADH基因的克隆gBADH1 和gBADH2 推测的外显子序列分别与BADH5和BADH3 完全一致 ,且gBADH1 和gBADH2 的内含子插入位置和大小有较大差异。表明三角叶滨藜BADH基因是一个多基因家族 ,至少存在

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在棉花中的过量表达和抗冻耐逆性分析

分离出菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因(SoBADH)构建成由CaMV35S驱动的双元植物表达载体pBSB,农杆菌菌株LBA4404携带该载体转化棉花,获得转基因棉花植株。65株转基因植株经过PCR筛选、Southern blotting分析证明有45株为成功的转化株,外源基因已经被整合到棉花的染色体组中,并以单拷贝插入居多。对部分株系的SoBADH基因的表达进行分析表明均有较高的mRNA和蛋白的表达。经测定这些株系中的甜菜碱脱氢酶活性显著提高,达到0.66～1.70nmol/min/mg水平。同时这些转基因株系在盐胁迫下比对照长势强,株高和地上部分的鲜重显著高于非转基因对照;在低温胁迫下,这些转基因株系表现出显著的抗冻性能。结果表明菠菜甜菜碱醛脱氢酶能够在异源植物棉花中过量表达,并具有较高的酶活性,转基因棉花可作为抗逆育种的种质材料。

转甜菜碱醛脱氢酶基因玉米及其耐盐性研究

构建了一个含有甜菜碱醛脱氢酶基因的表达载体，应用基因枪转化法将其转入玉米，获得了一些转基因植株。根据对目的基因的分子检测和对盐耐性的分析，证明转化的甜菜碱醛脱氢酶基因已整合入玉米染色体组，并且转基因玉米提高了对盐的耐性。

四倍体刺槐转甜菜碱醛脱氢酶基因的研究

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens Conn)介导法,将山菠菜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因转入四倍体刺槐(Robinia pseudoacacia L.)。结果表明,以愈伤组织作为外植体、液体分化培养基(MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1)活化农杆菌、转化培养基中2 0 mg·L-1乙酰丁香酮、菌液浓度OD600值0.3-0.7、预培养1～2d、浸染4～8 min、共培养4～8 d、延迟1 5 d选择的条件下,4 00 mg·L-1头孢霉素可有效抑制农杆菌,卡那霉素为5 0 mg·L-1时愈伤组织上芽的白化率达97.3％。经PCR和PCR-Southecn检测,外源基因已成功整合到植株基因组DNA中;转化植株丛生芽生长的NaCl相对抗性提高了2‰～3‰。

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析

以耐盐的菠菜mRNA为模板,经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR),扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pUC19转化至E.coli DH5α菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99.8％,氨基酸序列同源性达99.6％。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体。

通过农杆菌介导法获得耐盐转甜菜碱醛脱氢酶基因白三叶草

通过农杆菌介导法将耐盐植物山菠菜甜菜碱醛脱氢酶 (BetaineAldehydeDehydrogenase ,BADH)基因成功地转化了白三叶草。转基因植株在经过 4 8h 1%NaCl胁迫后相对电导率为 2 0 %左右 ,而非转基因植株高达 4 0 % ,表明转基因植株细胞膜在盐胁迫下受到的伤害较非转基因的轻 ,并且转基因植株能够在含有 0 5 %NaCl的水培养中正常生长两周以上 ,而非转基因植株则呈现不正常生长。

盐胁迫下转甜菜碱醛脱氢酶基因水稻幼苗耐盐生理的研究

在NaCl浓度0,3.0,5.0,7.0 g／L下,对转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因水稻的两个品系51-22,52-7及其受体亲本中花8号进行幼苗耐盐性试验。结果表明:转.BADH基因水稻比其受体亲本耐盐性强,在高NaCl浓度(5.0,7.0 g／L)胁迫下,甜菜碱醛脱氢酶基因可以提高盐胁迫下水稻幼苗过氧化氢酶(CAT)活性,提高根系活力和叶绿素含量,稳定细胞膜的透性,降低植株体内Na+的积累,从而减轻幼苗受盐害的程度。盐胁迫下水稻幼苗的CAT活性、SNa+／K+、叶Na+／K+、叶绿素含量是影响幼苗生长的主要生理指标。

梭梭甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及序列分析

采用RT-PCR、RACE等方法从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中扩增出BADH基因的cDNA序列(命名为HaBADH),其开放阅读框为1 503 bp,推测的氨基酸序列全长为500个氨基酸残基,并含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽(VTLELGGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(C)。其核苷酸序列与藜科几种盐生植物如盐爪爪(Kalidium foliatum)、中亚滨藜(Atriplex centralasiatica)、三角叶滨藜(Atriplex triangu-laris)、菠菜(Spinacia oleracea)、山菠菜(Atriplex hortensis)和甜菜(Beta vulgaris)等的相似性均在85%以上,推导编码蛋白的氨基酸序列一致性均在87%以上,表明BADH基因在藜科植物中是一种比较保守的基因。研究结果为进一步从分子水平探明梭梭的抗旱、耐盐机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础。

盐生植物盐节木甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达

采用RT-PCR、RACE技术从盐生植物盐节木(Halocnermum strobilaceum(Pall.)Bieb.)中克隆得到BADH基因的cDNA序列(命名为HsBADH),3'RACE和5'RACE测序结果用DNA Man软件拼接获得了1 849 bp全长的HsBADH cDNA序列(GenBank登录号:JN969894)。其开放阅读框为1 503 bp,推测编码501个氨基酸残基,并含有高度保守的十肽基序(VTLELGGKSP)和与酶功能有关的醛脱氢酶Cys残基。其核苷酸序列与几种藜科植物如梭梭、白梭梭、盐穗木、碱蓬、滨藜、菠菜、山菠菜的同源性为86%,与甜土植物水稻的同源性为66%。氨基酸序列与以上两类植物(盐生植物和甜土植物)的同源性比对分别为89%和70%,说明BADH基因在藜科盐生植物中是一种较高保守的基因。用不同浓度的NaCl胁迫处理盐节木植株,BADH mRNA的表达水平比对照植株高,说明盐节木BADH基因的表达受盐诱导,进一步说明甜菜碱醛脱氢酶催化合成的甜菜碱作为渗透调节的小分子物质,它的积累与盐胁迫存在紧密关联,本研究为进一步从生理和分子水平阐明盐节木的适应盐渍化生境的机制提供一定的参考。

辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)启动子分离及序列分析

根据已知的辽宁碱蓬BADHcDNA5′端序列设计两个基因特异的反向引物(BR1,BR2),通过衔接头PCR获得了BADH基因起始密码子上游265bp的序列。根据所获得的序列设计两个基因特异的反向引物(BR3,BR4),用BR2、BR3、BR4分别与4个简并引物配对,通过TAILPCR扩增,获得了约2kb的序列。经Sequencer软件拼接上述两段序列,获得了BADH基因起始密码子上游2055bp的序列。用TSSPTCM软件分析此序列,预测出转录起始点(T)位于起始密码子上游62bp处,由此获得了1993bp的SlBADH启动子序列。用PLACE软件分析此序列,发现该序列具有启动子的基本元件TATAbox、CAATbox,包含多个胁迫诱导元件,如盐诱导元件GAAAAA,抗冻、缺水、脱落酸、抗寒元件CANNTG,伤害诱导元件ANATTNCNN,热激元件ATAAATGT等,是一个强的胁迫诱导启动子。

转甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草抗旱及耐盐性

将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因与组成型启动子CaMV35S启动子融合,构建了植物表达质粒pBIBB。通过根癌农杆菌介导将BADH基因导入烟草,经PCR、Southern杂交、Northern杂交证明BADH基因已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定转基因植株叶片中甜菜碱醛脱氢酶活性,结果显示对照植株没有BADH酶活性,转基因植株的各个株系间甜菜碱醛脱氢酶比活力差异较大,范围在0.1～1.0Umg-1间。转BADH基因的烟草在盐胁迫和聚乙二醇(PEG)胁迫条件下生长状态良好,生长势强于未转基因植株,说明BADH基因能在异源植物中正常翻译、表达和用于植物抗旱、耐盐基因工程的研究。

转甜菜碱醛脱氢酶基因豆瓣菜的耐盐性

将山菠菜甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)基因经根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)AGL1介导转入豆瓣菜 (NasturtiumofficinaleR .Br.) ,PCR和Southernblotting检测呈阳性的再生植株有 46株 ;对 6株再生植株的BADH活性和Northernblotting检测发现 ,有 5株BADH酶活性明显高于对照 ;膜的相对电导率测定结果说明 ,在盐胁迫下转基因豆瓣菜的膜结构所受损伤小于对照。转基因植株能够在 0 .5 %NaCl培养基上正常生长 ,而对照在相同的培养基上生根困难且生长缓慢。在 0 .8%NaCl的培养基上 ,部分转基因植株虽然生长减慢 ,但生长状况明显优于对照 ,且对照植株在相同培养基上培养 2 0d到 1个月左右后 ,叶片变黄并最终死亡。

逆境下转BADH基因小麦甜菜碱醛脱氢酶活性表达与甜菜碱积累

对盐、旱逆境下转BADH基因小麦品系99T6的生长发育、甜菜碱醛脱氢酶活性及甜菜碱积累等进行了研究分析,结果表明,转BADH基因株系在盐逆境下具有明显的生长优势,耐盐能力达到100mmol/L;电导率和质膜相对透性表明转基因株系抗膜损伤能力增强;甜菜碱醛脱氢酶活性的增强和甜菜碱积累的增加,说明转基因株系的盐旱逆境抗性是通过甜菜碱积累这一长期、持久的方式解除渗透胁迫,而不是通过脯氨酸积累这种临时的应急反应;以甜菜碱作为靶标性状采用基因工程方法提高植物盐旱耐性是可行的。

枸杞甜菜碱醛脱氢酶基因全长cDNA的克隆与表达分析

根据GenBank中的植物甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的同源保守区设计简并引物,采用RT-PCR技术从枸杞中扩增出BADH基因的部分保守序列,并利用巢式PCR、5′-RACE和3′-RACE获得BADH基因的全长cDNA。测序结果表明:BADH全长为1 869 bp,包含1 512 bp长的开放读码框(ORF),编码1个含503个氨基酸残基、分子质量为55.12 ku、等电点(PI)为5.19,包括醛脱氢酶高度保守序列VTLELGGKSP和其后287 bp处与酶功能有关的Cys的假定蛋白质。mRNA分析表明:BADH基因在枸杞幼苗组织中受高盐胁迫和低温胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在植物抵御非生物胁迫中发挥重要作用。