孕酮诱导非洲爪蟾卵母细胞生发泡破裂(GVBD)试验方法的优化及干扰物质筛查

非洲爪蟾卵母细胞生发泡破裂(GVBD)是生物学上研究卵细胞成熟过程及其机制的良好模型。由于GVBD受激素的调控,曾有研究将孕酮诱导的非洲爪蟾GVBD试验用于内分泌干扰物的筛查。通过预注射人体绒毛膜促性腺激素(HCG)提高非洲爪蟾卵母细胞对孕酮的敏感性、缩小个体差异,缩短试验时间等优化GVBD试验方法;并选用甲氧氯作为阳性参照物对优化的方法进行验证,最后用此方法研究了米非司酮、来曲唑、咪鲜胺3种化学物质对孕酮诱导GVBD的影响。结果发现,甲氧氯对GVBD的发生具有明显抑制作用,随着剂量的增加抑制作用增强,显示优化方法的可靠性。米非司酮作为孕酮受体拮抗剂,没有表现出抑制GVBD的效应,证明孕酮诱导爪蟾GVBD并非完全由孕酮受体(PR)介导。同时,来曲唑和咪鲜胺对孕酮诱导爪蟾GVBD没有影响,显示此两种物质在孕酮诱导GVBD过程中不具有内分泌干扰作用。

小鼠卵母细胞生发泡破裂前的钙离子波动及分布

用显微操作技术将Ca2 + 特异荧光染料Calcium greenTM 1注射入GV期卵母细胞的细胞质内 ,在激光扫描共聚焦显微镜下观察生发泡破裂前Ca2 + 的时间和空间分布的变化 ,利用Lasersharp软件进行分析 ,发现一种有规律的Ca2 + 波动 ,其波动周期约为 90s .卵母细胞内Ca2 + 的分布并不均匀 ,核膜周围的Ca2 + 浓度最高 ,细胞质中次之 ,而生发泡内部Ca2 +

uPA对体外成熟牛卵母细胞生发泡破裂的影响

为了探明尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）对体外成熟牛卵母细胞核成熟的可能作用,试验根据uPA及其特异性抑制剂（amiloride）的有效浓度分成4组,即对照组、uPA（0.5 ng/mL）组、amiloride（1μg/mL）组及联合添加（uPA＋amiloride）组,然后采用地衣红染色方法分别研究体外成熟培养6 h与12 h后uPA对牛卵母细胞生发泡破裂（GVBD）的影响,采用ELISA方法研究体外成熟培养6 h后uPA对牛卵丘-卵母细胞复合体（COCs）中cAMP水平变化的可能调节作用。结果表明：减数分裂不同时期（GV期、GVBD期及MⅠ~MⅡ期）卵母细胞染色质（体）形态呈现不同特征。卵母细胞在体外成熟培养6 h后各组细胞均处于GV^GVBD期,其中uPA组GVBD期卵母细胞率（12.72%）显著低于对照组（24.83%）与联合添加组（30.42%,P〈0.05）;体外成熟培养12 h后,uPA组GVBD期卵母细胞率（54.81%）显著高于对照组（37.49%）与联合添加组（25.64%,P〈0.05）,uPA组MⅠ~MⅡ期卵母细胞率（44.85%）显著低于对照组（62.51%）与联合添加组（74.36%,P〈0.05）;体外成熟培养6 h后,uPA组cAMP水平显著高于对照组与联合添加组（P〈0.05）。说明uPA通过上调cAMP水平阻滞牛卵母细胞的减数分裂进程。

14-3-3ε和Cdc25B在小鼠卵母细胞生发泡期阻滞中的作用

目的:研究14-3-3ε和Cdc25B对小鼠卵母细胞生发泡(GV)期阻滞作用的影响,为阐明蛋白激酶A/Cdc25B/14-3-3ε通路在小鼠卵母细胞GV期阻滞中发育调控机制奠定基础。方法:在体外将表达载体pcDNA3.1-ZEO-HA14-3-3ε、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321A和pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321D转录成mRNA。超排卵方法获得小鼠GV期卵母细胞,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3εmRNA单独注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-WT(野生型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321D(模拟磷酸化型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321A(突变型)mRNA共注射组,收集各组母卵细胞后采用Western blotting法检测外源性14-3-3ε和Cdc25B蛋白表达及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态;相差显微镜观察卵母细胞的形态学变化并计数生发泡破裂(GVBD)率。结果:未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3εmRNA单独注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-WT(野生型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321D(模拟磷酸化型)mRNA共注射组在显微注射后20h均未发生GVBD(P>0.05);14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321A(突变型)mRNA共注射组在显微注射后1、2和3h卵母细胞的GVBD率分别为(5.00±0.68)%、(62.00±3.56)%和(100.00±0.00)%,显微注射后20h到达第2次减数分裂中期(MII)的比例为(79.00±2.80)%,与未注射组和TE缓冲液注射组比较,GVBD率和到达MII的比例均显著升高(P<0.01)。结论:14-3-3ε通过Cdc25B的321位丝氨酸磷酸化和脱磷酸化调控卵母细胞由GV期向GVBD的过渡。

表皮生长因子调节小鼠生发泡期卵母细胞发育成熟的实验研究

目的 :观察表皮生长因子 ( EGF)对生发泡期 ( GV期 )卵母细胞生发泡破裂( GVBD)、第一极体 ( FP)形成的影响。方法 :体外培养的昆明种雌性小鼠 GV期卵母细胞分为卵丘卵母细胞复合体 ( COC)组及去卵丘裸卵 ( DO)组 ,观察不同浓度 ( 0、2、5、1 0、1 5μg/ L ) EGF对体外培养 0、4、8、1 2、2 4、3 6、48h COC、DO各组 GVBD、FP形成的影响。结果 :( 1 ) EGF可促进 DO组的卵母细胞成熟分裂 ,培养 48h EGF各组与对照组相比 ,有显著性差异 ( P<0 .0 5) ;( 2 ) COC组培养 3 6h后 EGF各组成熟率均显著大于对照组 ( P<0 .0 5) ;( 3 )不论是否存在 EGF,COC组成熟分裂率均显著高于 DO组 ( P<0 .0 5) ;( 4)EGF作用呈剂量依赖性。结论 :EGF不仅可促进 COC组 GVBD发生、FP形成 ,而且可不通过卵丘细胞直接刺激卵母细胞成熟 ,EGF对 COC促进作用强于 DO,并呈剂量依赖性。

内皮素-1调节小鼠生发泡期卵母细胞体外成熟作用的实验研究

目的研究内皮素-1(ET-1)对小鼠未成熟卵母细胞生发泡破裂(GVBD)、第一极体(PBⅠ)排出的影响。方法昆明系雌性小鼠生发泡(GV期)卵母细胞分为去卵丘裸卵(DO)组及卵丘卵母细胞复合体(COC)组,在体外培养条件下,观察ET-1对两组GVBD、PBⅠ形成的量效和时效关系。结果(1)DO在10-9、10-8、10-7、10-6mol/LET-1作用3、6、9、12、24h对其成熟分裂无明显影响(P>0.05);(2)COC在10-8mol/LET-1作用6h能显著抑制GVBD率(P<0.05),在10-7、10-6mol/LET-1作用6h极显著抑制GVBD率(P<0.01);在10-8mol/LET-1作用12h明显抑制PBⅠ率(P<0.05),10-7、10-6mol/LET-1作用12h极显著抑制PBⅠ率(P<0.01)。结论ET-1对COC体外成熟具有抑制作用并呈剂量依赖性,对DO体外成熟无明显影响。

SGK3在小鼠卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用及其机制

目的:探讨血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶3(SGK3)在小鼠卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用,初步阐明SGK3在哺乳动物卵母细胞早期发育中的调控机制。方法:利用超排卵技术获取生发泡(GV)期小鼠卵母细胞,利用显微注射技术将表达质粒体外转录获得的SGK3 mRNA注射至GV期卵母细胞,分为对照组、Tris-EDTA缓冲液(TE)组和SGK3 mRNA组,采用Western blotting法检测各组小鼠卵母细胞中SGK3蛋白表达水平,显微注射SGK3 mRNA后1、2、3和4 h观察并计算各组卵母细胞生发泡破裂(GVBD)率,采用SGK3抗体稀释抑制实验观察各组卵母细胞形态表现,采用Western blotting法检测体外培养不同时间点卵母细胞中磷酸化SGK3(pSer48)(SGK3-pSer48)和磷酸化细胞分裂周期蛋白2(CDC2)(pTyr15)(CDC2-pTyr15)蛋白表达水平。结果:与对照组和TE组比较,SGK3 mRNA组小鼠卵母细胞中SGK3蛋白表达水平升高(P<0.01),显微注射后1和2 h时GVBD率升高(P<0.01)。SGK3抗体稀释抑制实验,随着SGK3抗体浓度增加,各组小鼠卵母细胞GVBD率呈浓度依赖性降低。过表达SGK3后,与对照组比较,SGK3 mRNA组小鼠卵母细胞中检测不到CDC2-pTyr15蛋白表达的时间至少提前1 h。不同稀释浓度SGK3抗体作用后,与对照组比较,随着SGK3抗体浓度升高和时间的延长,小鼠卵母细胞中CDC2-pTyr15蛋白表达水平逐渐降低(P<0.01),SGK3-pSer486蛋白表达水平逐渐升高(P<0.01)。结论:过表达SGK3可以增加小鼠卵母细胞GVBD率,加快CDC2-pTyr15的脱磷酸化,而CDC2-pTyr15的脱磷酸化晚于SGK3-Ser486的磷酸化。SGK3可能作为CDC2上游调节因子参与调控小鼠卵母细胞第一次减数分裂的恢复。

生物科学专业开设卵母细胞体外成熟实验

为了使学生更好地理解减数分裂和卵母细胞成熟过程,引入卵母细胞体外成熟实验。取青春期雌性小鼠卵巢,通过机械穿刺的方法,释放皮质区卵泡内的卵母细胞,收集生发泡期(Germinal Vesicle,GV)卵母细胞,进行成熟培养16~18 h后,观察并比较GV期、生发泡破裂期(GV Breakdown,GVBD)和MⅡ各时期卵母细胞的形态特征。收集MⅡ期卵母细胞,通过核染料Hoechst33342染核观察。荧光显微镜下排出第1极体的卵母细胞可见一大核(卵母细胞核)和一小核(极体核)。该实验项目的开设可以帮助学生更好地理解减数分裂的概念以及减数分裂Ⅰ的进程。

镉对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响

采用小鼠卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究了ＣｄＣｌ２对小鼠卵母细胞的生发泡破裂（ＧＶＢＤ）、第一极体释放及体外受精（ＩＶＦ）的影响．结果表明，ＣｄＣｌ２对ＧＶＢＤ没有影响，但可以抑制卵母细胞第一极体的释放，影响卵母细胞的存活率并可降低ＩＶＦ频率ＣｄＣｌ２影响极体释放和ＩＶＦ率可能是其对纺锤体的破坏，使得减数分裂不能正常进行，同时还可能影响微丝等细胞骨架成分，阻止正常胞质分裂实验结果还显示，ＣｄＣｌ２这种抑制作用可能是可逆的，或者仅仅是对减数分裂的延迟作用．

汞对雌性小鼠生殖功能及脏器的影响

为探讨汞化合物对脏器及生殖的毒性,采用卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究了汞对小鼠脏器系数、卵母细胞成熟和受精能力的影响。结果表明,0.5和1.5mg/kgBW汞对小鼠的肝脏、肾脏有明显的毒性作用,1.5mg/kgBW组还对卵巢有明显的毒性作用,并能显著降低超排卵的卵母细胞数;汞对体内卵母细胞生发泡破裂没有影响,但可以抑制卵母细胞第一极体的释放,影响卵母细胞的存活率并降低体外受精(IVF)率。结果提示,氯化汞可以影响卵母细胞的成熟,明显破坏卵母细胞的体外受精能力,损伤或降低小鼠的生殖能力。

日本鳗鲡排卵的人工诱导

对日本鳗鲡(Anguillajaponica)卵巢发育的时间与催产率的关系进行研究,对卵母细胞在体内胚泡破裂(GVBD)的发生过程、以及用17α-OHP和17α,20β-DHP诱导日本鳗鲡排卵的方式、时机和催产效果进行观察,结果表明,卵巢发育时间越长,催产率越低。造成催产率低的原因主要是由于日本鳗鲡在卵母细胞成熟后期,雌鳗个体对催产药物敏感性差异较大,催产时机难以掌握。通过采用适合日本鳗鲡卵母细胞的透明液观察GVBD的发生过程,并根据每个个体GVBD的发生速度,制订适宜的催产方案基本解决了上述难题。本实验采用CP、HCG、17α-OHP或17α,20β-DHP混合催产,使其平均催产率由35 4%分别提高到91 9%和93 0%。17α-OHP和17α,20β-DHP的催产剂量为5mg/(500g)和10mg/(500g)。在(21±0 5)℃水温条件下,催产效应时间分别为15～18h和13～16h。

甲醛对雌性小鼠生殖功能及脏器的影响

采用超排卵技术研究甲醛对小鼠卵母细胞的成熟和体外受精以及脏器等的影响。甲醛对小鼠卵母细胞生发泡破裂没有影响,但可以抑制卵母细胞第一极体的释放,影响卵母细胞的存活率和破坏卵母细胞成熟,并可降低体外受精率和超排卵的卵母细胞数量,影响小鼠的正常生殖功能。而且,高剂量的甲醛还对小鼠的肝脏以及卵巢有明显的毒副作用。

香烟烟雾水溶物对小鼠卵母细胞成熟和IVF的影响

采用小鼠卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究不同产地 3种香烟的烟雾水溶物对小鼠卵母细胞成熟和受精能力的影响。结果显示 3种香烟烟雾水溶物对卵母细胞生发泡破裂都没有影响 ,但可以显著地抑制卵母细胞第一极体的释放、降低卵母细胞的体外受精率和体外存活率。结果提示 ,香烟烟雾中影响生殖作用的主要成分是其中的水溶性成分 ,它们可以破坏卵母细胞的成熟、降低卵细胞的受精能力 ,对生殖细胞和生育能力有一定的毒性作用 ;不同产地、不同品牌香烟烟雾水溶物毒性作用相似。

雷公藤多甙对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响

采用超排卵技术研究雷公藤多甙(GTW)对小鼠卵母细胞的成熟和体外受精以及脏器等的影响,GTW对小鼠卵母细胞生发泡破裂没有影响,但可以抑制卵母细胞第一极体的释放,影响卵母细胞的存活率并可降低体外受精率和超排卵的卵母细胞数量。GTW可以破坏卵母细胞成熟,降低卵母细胞的体外受精能力,影响小鼠的正常生殖功能。

褪黑素对FSH诱导的小鼠卵母细胞体外成熟的影响

通过次黄嘌呤(HX)阻滞、FSH诱导体外培养模型研究了褪黑素(MT)对小鼠卵母细胞成熟的影响,探讨褪黑素(MT)是否影响小鼠卵母细胞的体外成熟。0.1mg/mL和0.02mg/mL两有效浓度的MT能显著抑制促性腺激素(FSH)诱导的HX阻滞的CEOsGVBD的发生(P<0.05),对PBl的排出虽有一定的抑制作用,但没有统计学意义;MT和次黄嘌呤(HX)对CEOs的自发成熟有协同抑制作用(P<0.01),但在裸卵(DO)自发成熟的阻滞中没有协同效应。MT是调节哺乳动物卵母细胞成熟的重要激素之一,其作用机制可能是通过卵丘细胞实现的。

镍对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响

为了研究镍的生殖毒性 ,采用卵母细胞体外培养、体外受精的方法研究镍对小鼠卵母细胞的成熟和体外受精率的影响。结果 :氯化镍对卵母细胞生发泡破裂没有影响 ,但抑制卵母细胞第一极体的排放 ,降低体外受精率 ,并降低卵母细胞的存活率。实验结果提示 ,氯化镍破坏小鼠卵母细胞的减数分裂 ,影响小鼠的生殖功能。

卵丘细胞对小鼠卵母细胞体外成熟及其后续发育的影响

观察了卵丘细胞共培养对小鼠生发泡期部分裸露(PNO)和裸卵(NO)成熟和发育能力的影响;分别用小鼠、大鼠、猪的卵丘细胞与小鼠PNO和NO进行了共培养。检测了小鼠PNO和NO的减数分裂能力、生发泡构型、受精和胚胎发育能力。结果,PNO、NO的减数分裂能力显著(P<0.05)低于卵丘完整复合体(COCs)的减数分裂能力。COCs中SN型卵母细胞比率显著高于PNO和NO中SN型卵母细胞比率(P<0.05),大部分PNO和NO的卵母细胞核型为NSN型。与对照组相比,与小鼠或大鼠卵丘细胞共培养的小鼠PNO和NO的减数分裂能力没有显著提高,但是与猪卵丘细胞共培养却可以提高小鼠PNO和NO的减数分裂能力。结果表明,猪卵丘细胞能促进小鼠卵母细胞的体外成熟,但并不影响小鼠卵母细胞的受精和胚胎发育。

小鼠卵母细胞中14-3-3蛋白亚型的表达

目的对小鼠卵母细胞生发泡期(GV)、生发泡破裂期(GVBD)的14-3-3蛋白亚型表达进行鉴定。方法RT-PCR法检测GV、GVBD期卵母细胞中14-3-3蛋白7个亚型的mRNA水平,蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测其蛋白表达水平。结果检测了7个14-3-3亚型(β,γ,ε,σ,ζ,τ和η)mRNA的表达水平,结果显示,在GV期只有14-3-3β和14-3-3ε两个亚型表达,并且14-3-3εmRNA水平显著高于14-3-3β(P<0.01)。在蛋白水平上,在小鼠卵母细胞GV期和GVBD期均检测到14-3-3ε亚型蛋白表达,未检测到14-3-3β蛋白表达。结论 14-3-3蛋白ε亚型在小鼠卵母细胞GV、GVBD期均稳定表达。

蟾蜍泛素羧基末端水解酶(tUCH)以不依赖其UCH活性的方式参与卵母细胞成熟调控

本实验室已报道中华大蟾蜍卵母细胞的p28蛋白具泛素羧基末端水解酶活性,称作tUCH,它和哺乳类中发现的UCH L1的氨基酸序列具高度同源性,二级结构同源性比较发现,二者可能具类似的功能。本文实验表明:未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞的可溶性蛋白中均含有tUCH,约占提取物中蛋白质总量的2%。根据测定所得到的GST-tUCH和GST-UCH L1对底物Ub-AMC的酶动力学参数,说明卵母细胞中tUCH可能与小鼠UCH L1有类似的生物学功能;anti-tUCH单抗可以与原核细胞表达的tUCH和显性失活突变类型tUCH C(90)S特异结合,但不识别小鼠的UCH L1。Anti-tUCH单抗能够和tUCH结合但不能封闭它的UCH活性。当anti-tUCH单抗注入卵母细胞内,则孕酮诱导的生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)过程受到抑制,足见tUCH参与GVHD调节并不依赖其UCH活性。